李小鷗， 黃 巍， 陳亞雋， 周麗榮

(1武漢大學人民醫(yī)院兒科，湖北 武漢430070;2武漢市醫(yī)學科學研究所，湖北 武漢430032 3華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，湖北 武漢430030)

神經型鈣黏蛋白(neural cadherin，N－cadherin)是調節(jié)細胞與細胞之間、細胞與基質之間黏附反應的重要媒介，對維持組織結構形態(tài)起重要作用。N－cadherin 與連環(huán)蛋白(catenins)形成N－cadherin/catenins 復合體(鈣－連復合體)可使N－cadherin 集中定位細胞與細胞間的接觸部位，該復合體任何一種成分異常都會影響到N－cadherin 介導的細胞黏附功能。

基于對N－cadherin 加工代謝過程的深入了解，現(xiàn)已在成纖維細胞和神經細胞中發(fā)現(xiàn)N－cadherin 有一條非常重要的解整合素金屬蛋白酶家族ADAMs(a disintegrin and metalloproteinase proteins)加工途徑，ADAMs 在N－cadherin 胞外域N 端的R714－I715處將其水解，破壞了N－cadherin 的分子完整性，影響了鈣－連復合體的形成，導致其功能喪失并引發(fā)相應的病理生理改變［1－2］。研究表明在成纖維細胞和神經細胞中，N－cadherin 的ADAMs 加工途徑對相應系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮起關鍵作用［2］，參與上述加工途徑的蛋白水解酶主要是ADAM 家族中的ADAM9、ADAM10 和ADAM17，特別是ADAM10 發(fā)揮了尤為重要的作用［3］。但是心肌細胞中ADAMs 和N－cadherins 相互作用的研究僅是開始，很多問題尚不清楚，本研究將靶向沉默ADAM10 的siRNA 表達載體導入大鼠心肌細胞，并建立穩(wěn)定表達的細胞系，通過觀察該載體對細胞N－cadherin 的ADAMs 加工途徑的影響，以明確心肌細胞中ADAM10 在N－cadherin 底物加工過程中的重要性，目的是為探求該加工途徑在維持心肌組織結構形態(tài)和完整性中的作用打下基礎。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

大鼠ADAM10 干擾載體［sc－270165 ADAM10 siRNA(r)］購自Santa Cruz，兔抗ADAM10 抗體購自eBioscience，兔抗N－cadherin 抗體購自Abcam，AP 標記羊抗兔抗體購自Santa Cruz。嘌呤霉素購自Sigma。轉染試劑脂質體LipofectamineTM2000 為Invitrogen 產品。

2 方法

2.1 細胞復蘇與培養(yǎng) 大鼠心肌細胞(H9c2)購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。液氮中取出H9C2 細胞，37 ℃水浴化凍，快速放入含10%胎牛血清、0.5% 青鏈霉素的MEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，生長至90% 密度時傳代，轉染前1 d 換無抗生素的培養(yǎng)液過夜。

2.2 建立穩(wěn)定表達的H9c2 細胞株 轉染前1 d 取對數生長期的H9c2 細胞以2 ×105cells/well 的密度接種于24 孔板。無抗生素MEM 培養(yǎng)液(10%FBS)培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁生長達80%～90%融合時，棄去細胞培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液洗滌細胞1 次，然后按脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000 的說明書將提取并純化的sc－270165 ADAM10 siRNA(r)質粒轉染H9c2 細胞，轉染后4 h 更換培養(yǎng)液，用含5 mg/L 嘌呤霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)，48 h 觀察瞬時表達情況，3 ～4 d 后當對照組細胞大部分死亡時，根據嘌呤霉素最小致死濃度實驗，改用3 mg/L 的嘌呤霉素維持篩選，每2 ～3 d 換液傳代，2 周后抗性克隆初步形成。在細胞融合達80%時，將細胞移至6 孔板培養(yǎng)，篩選單克隆至培養(yǎng)瓶中擴增，并在細胞的對數生長期收集細胞，進行各項實驗。

2.3 Western blotting 檢測ADAM10 蛋白的表達 RIPA 法提取轉染組和空白對照組細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。50 μg 總蛋白進行10% SDS－PAGE 電泳，300 mA 2h 轉至NC膜。NC 膜經5%脫脂奶粉的TBS－T 溶液室溫封閉2h 后，與兔抗鼠ADAM10 抗體(1∶600)4 ℃孵育過夜。TBS－T 溶液洗膜3 次后，NC 膜與HRP 標記羊抗兔II 抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBS－T 溶液再次漂洗3 次后ECL 化學發(fā)光觀察。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。實驗重復3 次。

2.4 Western blotting 檢測N－cadherin 及其C 末端片段(Cterminal fragment，CTF) I 抗為兔抗N－cadherin 的多克隆抗體，抗原識別表位針對N－cadherin 的C 端，也識別CTF，其余方法同2.3。

2.5 流式細胞技術檢測心肌細胞跨膜表達的N－cadherin

用PBS 將上述離心后的細胞吹打下來，再用PBS 洗2 次后，加入以PBA(含10%BSA)1∶100 稀釋的抗N－cadherin 抗體，4 ℃作用1 h，PBS 洗2 次，加入1∶60 稀釋的熒光II 抗，4 ℃作用1 h，PBS 洗2 次，細胞懸浮0.5 mL PBS，進行流式細胞術檢測N－cadherin。

2.6 心肌細胞黏附實驗 每孔100 μL 纖維連接蛋白(10 mg/L)包被96 孔板，以100 mg/L 多聚賴氨酸和1%牛血清白蛋白包被孔作為最大和最小黏附參照。將空白對照組和穩(wěn)轉細胞組細胞分別制備成5 ×108cells/L 細胞懸液，每孔加入100 μL，37 ℃、5% CO2、飽和濕度孵育3 h。磷酸鹽緩沖液洗滌除去未黏附細胞，多聚甲醛固定，1% 亞甲藍溶液染色20 min，每孔加入100 μL 1 mol/L HCl，37 ℃40 min，酶標儀測定600 nm 處吸光度(A)，細胞黏附率(%)= (實驗組A 值－牛血清白蛋白孔A 值)/(多聚賴氨酸孔A 值－牛血清白蛋白孔A 值)×100%。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 穩(wěn)轉細胞株的建立

脂質體法轉染H9c2 細胞，經嘌呤霉素篩選后建立穩(wěn)定表達細胞株。Western blotting 檢測ADAM10 蛋白的表達，見圖1。結果顯示與對照組相比，轉染ADAM10 siRNA 細胞的ADAM10 蛋白水平降低了75.2%。表明本實驗所用的siRNA能有效而特異地沉默ADAM10 基因，抑制其蛋白表達。

Figure 1. Expression of ADAM10 protein detected by Western blotting.圖1 轉染組與對照組ADAM10 蛋白的表達

2 Western blotting 檢測細胞N－cadherin 及其CTF 蛋白表達

Western blotting 檢測ADAM10 siRNA 轉染組和對照組N－cadherin 及其CTF 蛋白表達。轉染組細胞中N－cadherin蛋白的表達較正常細胞明顯增多，CTF 蛋白表達明顯減少，見圖2。

3 流式細胞術檢測心肌細胞表面N－cadherin 表達的變化

陰性對照組N－cadherin 的表達為(42.23 ±2.52)%，轉染組心肌細胞表面N－cadherin 的表達為(73.48 ±3.41)%，與對照組相比明顯增多(P ＜0.05)。

Figure 2. The expression of N－cadherin and its C－terminal fragment (CTF)detected by Westem blotting. * P ＜0.05 vs control.圖2 N－cadherin 及其CTF 的蛋白表達

4 細胞黏附實驗

陰性對照組細胞黏附率為(40.21 ±4.50)%，ADAM10 siRNA 轉染組為(60.23 ±6.50)%，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，表明轉染組心肌細胞黏附率較對照組明顯升高。

討 論

眾所周知，閏盤是心肌細胞的連接結構，使心肌形成一個功能上的整體。鈣－連復合體作為心肌細胞閏盤中間連接的一個重要組成成分，是形成閏盤結構的關鍵分子基礎，已成為近年來的研究熱點。鈣－連復合體位于閏盤的黏合膜，同時也是肌原纖維的附著點，在心肌細胞的發(fā)育及成熟階段高度表達［4］。它同細胞骨架的相互聯(lián)系和相互作用有重要功能［4］:(1)介導心肌細胞間的黏附反應，使心肌細胞形成牢固連接;(2)固定心肌纖維的定向排列，防止心肌纖維滑脫，保持心肌纖維舒縮的一致性和協(xié)調性。因此，鈣－連復合是心肌細胞形態(tài)維持、物質運輸和跨膜信息傳遞的重要結構基礎。

鈣－連復合體功能的正常發(fā)揮有賴于其完整性，其組成成員質和量的改變都可以引起復合體的功能異常。目前在成纖維細胞和神經細胞中發(fā)現(xiàn)ADAM10 可以特異性水解N－cadherin，產生N 端的NTF(95 kD)和C 端的CTF1(40 kD)，再由γ－分泌酶將CTF1 片段進行水解，產生可溶性的CTF2(35 kD)?？缒さ腘－cadherin 依次被ADAMs 和γ－分泌酶水解，分子的完整性遭到破壞，影響了鈣－連復合體的形成［4－5］。鑒于以上成纖維細胞和神經細胞中的研究結果，我們推測心肌細胞中N－cadherin 也存在這樣ADAMs 加工途徑，對N－cadherin 在細胞中的定位分布及鈣－連復合體的形成有重要作用

為了證明我們的推論，本實驗首先利用ADAM10 siRNA轉染入大鼠心肌細胞(H9c2)，通過嘌呤霉素篩選，成功獲得了ADAM10 穩(wěn)定沉默的心肌細胞株。Western blotting 檢測結果顯示ADAM10 siRNA 穩(wěn)轉細胞組與陰性對照組相比，N－cadherin 蛋白表達水平明顯提高，同時CTF 的表達也有所下調，流式細胞術的結果也提示轉染組心肌細胞跨膜表達的N－cadherin 增加。以上結果說明心肌細胞中ADAM10 對N－cadherin 的加工水解對N－cadherin 在細胞中的定位分布及鈣－連復合體的形成有重要作用。黏附實驗的結果表明轉染組心肌細胞黏附能力明顯提高，從而進一步明確了心肌細胞中ADAM10 對N－cadherin 的水解破壞了N－cadherin 分子的完整性，影響了鈣－連復合體的形成，并引發(fā)了相應的病理生理改變。

［1］ Matsuda T，F(xiàn)ujio Y，Nariai T，et al. N－cadherin signals through Rac1 determine the localization of connexin 43 in cardiac myocytes［J］.J Mol Cell Cardiol，2006，40(40):495－502.

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