高學(xué)玲 ，申 慧，鄒敏亮，楊素云

1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，合肥230036;2 湖南省祁陽縣食品藥品監(jiān)督管理局，祁陽426100;3健士星生物生物技術(shù)研發(fā)(上海)有限公司，上海200335

黃山貢菊原名“徽菊”，與杭菊、滁菊、亳菊共同收載于2010 年版中國藥典。黃山貢菊為菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥頭狀花序，具有疏風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒之功效［1］?，F(xiàn)代研究表明，貢菊花中含有酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油等多種有效成分［2-6］，具有抗氧化、抗癌、抗病毒等作用［7-9］。目前，關(guān)于黃山貢菊花中黃酮類和綠原酸類成分的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)黃酮類和綠原酸類成分在不同花期及采摘期動(dòng)態(tài)積累規(guī)律以及在長(zhǎng)期間黃山貢菊葉中動(dòng)態(tài)積累規(guī)律的相關(guān)研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本文在前期對(duì)黃山貢菊花高效液相色譜指紋圖譜研究的基礎(chǔ)上［10］，進(jìn)一步研究不同花期和采摘期黃山貢菊花中總黃酮和綠原酸動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及在不同生長(zhǎng)期內(nèi)貢菊葉中總黃酮和綠原酸動(dòng)態(tài)變化，以期為黃山貢菊花的合理采集及貢菊葉有效成分的進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃山貢菊花、葉均采自黃山天健農(nóng)業(yè)科技有限公司貢菊種植園，采后于60 ℃烘干，粉碎過20 目篩，封口包裝。置閉光、陰涼處存放，待用。

蘆丁、綠原酸(對(duì)照品，均購于中國藥品生物制品鑒定所，純度≥98%);磷酸(色譜純，美國Tedia公司);乙腈(色譜純，德國Merck 公司);硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、甲醇、無水乙醇均為分析純;超純水自制。

1.1.2 儀器

TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);1200LC 型高效液相色譜儀(美國安捷倫有限公司);KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DFY-500 搖擺式高速中藥粉碎機(jī)(浙江溫嶺市林大機(jī)械有限公司);DHG-9123A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海恒科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 黃山貢菊花和葉中總黃酮和綠原酸變化研究

1.2.1.1 不同花期貢菊花中總黃酮和綠原酸變化研究

選擇3 個(gè)不同花期進(jìn)行采摘，即花蕾(俗稱胎菊，管狀花開放程度小于10%的菊花)、中花期(管狀花開放程度約為50%的菊花)和大花期(管狀花開放程度大于70%的菊花)，研究不同花期貢菊花中總黃酮和綠原酸的動(dòng)態(tài)積累規(guī)律。

1.2.1.2 不同采摘期貢菊花中總黃酮和綠原酸變化研究

分別于2011 年10 月18 日、10 月21 日、10 月25 日、10 月27 日、10 月31 日、11 月3 日、11 月6 日和11 月11 日共8 次在同一菊花種植園采摘菊花樣品，以管狀花開放程度約為50%的貢菊花為采摘標(biāo)準(zhǔn)，研究不同時(shí)期花中總黃酮和綠原酸的動(dòng)態(tài)積累規(guī)律。

1.2.1.3 貢菊葉中總黃酮和綠原酸變化研究

分別于2011 年6 月26 日、7 月27 日、8 月25日、9 月25 日、10 月11 日、10 月25 日、11 月2 日和11 月11 日共8 次在同一菊花種植園采摘黃山貢菊葉，研究葉中總黃酮和綠原酸的動(dòng)態(tài)積累規(guī)律。

1.2.2 總黃酮含量的測(cè)定

1.2.2.1 樣品溶液的制備

精密稱取貢菊花樣品1.0 g，按1∶21 加72%乙醇，62 ℃超聲提取38 min，濾紙減壓抽濾，再用47%乙醇定容至50 mL，備用。

精密稱取貢菊葉樣品1.0 g，按1∶24 加47%乙醇，63 ℃超聲提取27 min，濾紙減壓抽濾，再用47%乙醇定容至50 mL，備用。

1.2.2.2 對(duì)照品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取盧丁對(duì)照品10.2 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇使其溶解，定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.204 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

精密吸取對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，各加水至6 mL，搖勻，加5% 亞硝酸鈉溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL。搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，分光光度法在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值。以吸光度A 值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，按濃度與吸光值相關(guān)關(guān)系求得回歸方程為Y = 0.01169×X -0.00794，r2= 0.9997。表明蘆丁在0.008～0.048 mg/mL 呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2.3 樣品的測(cè)定

精密吸取供試品溶液0.5 mL，置于25 mL 容量瓶中，加水至6 mL，搖勻，再按照1.2.2.2 項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定

1.2.3 綠原酸含量的測(cè)定

1.2.3.1 樣品溶液的制備

精密稱取樣品粉末1.0 g，按1∶20 加75%乙醇，60 ℃超聲提取30 min，濾紙減壓抽濾，再用75%乙醇定容至50 mL，過0.45 μm 濾膜備用。

1.2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

取綠原酸5.0 mg 加水溶解，定容至10 mL，即得母液0.5 mg/mL。再依次配制10、20、40、60、80 mg/L 的對(duì)照品溶液。

1.2.3.3 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Luna 苯基己基色譜分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:A:0.1%磷酸水溶液，B:乙腈;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):255 nm;進(jìn)樣量:5 μL 梯度洗脫條件見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

40.00 80 20 50.00 60 40 60.00 50 50 60.01 92 8 70.00 92 8

1.2.3.4 樣品的測(cè)定

按“1.2.3.1”項(xiàng)下條件制備貢菊花、葉供試品溶液，1.2.3.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花期貢菊花中總黃酮和綠原酸含量的變化

不同花期黃山貢菊花中總黃酮、綠原酸含量變化如圖1 所示。由圖1 中可知，不同花期貢菊花總黃酮和綠原酸含量差異明顯，其中貢菊花總黃酮和綠原酸含量最高值出現(xiàn)在中花期，分別達(dá)到123.12和5.86 mg/g ;大花期次之，花蕾最低。

圖1 不同花期貢菊花中總黃酮和綠原酸的含量Fig.1 The content of total flavonoids and chlorogenic acid in different blooming period of Flos chrysanthemum

2.2 不同采摘期貢菊花總黃酮和綠原酸含量的變化

圖2 不同采摘時(shí)期貢菊花總黃酮和綠原酸含量的變化Fig.2 Changes of total flavonoids and chlorogenic acid contents of Flos chrysanthemum in different picking period

不同采摘期貢菊花總黃酮和綠原酸含量的變化如圖2 所示。由圖2 可知，不同采摘期貢菊花中總黃酮含量存在較大差異，其中，在采摘中期(10 月27日)的貢菊花中總黃酮含量最高，為125.41 mg/g;采摘后期(11 月6 日)的貢菊花總黃酮含量最低，為73.37 mg/g 。貢菊花中綠原酸含量在采摘期的變化范圍為4.92～6.88 mg/g ，在采摘初期(10 月21日)最高，此時(shí)綠原酸含量為6.88 mg/g ，其次為采摘中期(10 月27 日)。

2.3 貢菊葉中總黃酮和綠原酸含量的變化

貢菊葉中總黃酮和綠原酸含量的變化如圖3 所示。由圖3 可知，隨著生長(zhǎng)期的不斷延長(zhǎng)，貢菊葉中總黃酮、綠原酸含量均呈逐漸上升趨勢(shì)，在生長(zhǎng)期后期(11 月2 日)總黃酮和綠原酸含量均達(dá)到峰值，分別為109.30 和7.87 mg/g ，隨后總黃酮和綠原酸含量均呈下降趨勢(shì)。

圖3 貢菊葉中總黃酮和綠原酸含量的變化Fig.3 Changes of total flavonoids and chlorogenic acid contents in leaves of Chrysanthemum morifolium Ramat.

3 結(jié)論與討論

3.1 傳統(tǒng)的菊花一般在完全開放后采收，但近年來，市場(chǎng)上有“胎菊”銷售，“胎菊”為幼小菊花花序的加工品，價(jià)格為普通菊花的數(shù)倍。本文研究發(fā)現(xiàn)貢菊花的花蕾中總黃酮和綠原酸含量均較低，而在中花期總黃酮、綠原酸含量均達(dá)到最高值，分別為123.12 和5.86 mg/g，其原因可能是由于菊花開放程度的不同其次生代謝物的產(chǎn)生、積累變化很大［11］;在不同采摘期中，貢菊花總黃酮、綠原酸含量變化波動(dòng)較大，采摘前期貢菊花中總黃酮和綠原酸的含量均高于采摘后期。

3.2 在黃山貢菊生長(zhǎng)過程中，隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，貢菊葉中總黃酮和綠原酸含量呈逐漸上升趨勢(shì)，并在后期達(dá)到較高的水平，其總黃酮和綠原酸含量最高分別達(dá)到109.30 和7.87 mg/g。在此時(shí)期采收貢菊葉可作進(jìn)一步的開發(fā)利用。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People's Republic of China (中華人民共和國藥典). Beijing:China Medical Scienc Press，2010.VolⅠ，292.

2 Long ZL，James M，Harnly. Identification of the phenolic components of chrysanthemum flower (Chrysanthemum morifolium Ramat).Food Chem，2010，120:319-326.

3 Zhang J(張健)，Qian DW(錢大瑋)，Li YB(李友賓)，et al. Chemical Constituents from Chrysanthemum morifolium Ramat.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2006，18:71-73.

4 Liu JQ(劉金旗)，et al.Studies on the Chemical Constituents from Chrysanthemum morifolium Ramat. Chin J Chin Mater Med (中國中藥雜志)，2001，26:547.

5 Shan Z，et al. Simultaneous determination of flavonoids in chrysanthemum by capillary zone electrophoresis with running buffer modifiers.Talanta，2008，76:780-784.

6 Wang YJ(王亞君)，et al.Characterization of chemical components of essential oil from flowers of Chrysanthemum morifolium produced in Anhui province. Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2001，33:2207-2211.

7 Dongxu He，et al.Total flavonoids of Flos Chrysanthemi protect arterial endothelial cells against oxidative stress. J Ethnopharmacology，2012，139:68-73.

8 Xiaoyan Pan，et al.Inhibition effects of human gastric carcinoma SGC-7901 cells on Chrysanthemum flavonoids in vivo.Procedia Engineering，2011，18:139-144.

9 S.Kumar，et al.Elimination of mixed infection of Cucumber mosaic and Tomato aspermy virus from Chrysanthemum morifolium Ramat. cv. Pooja by shoot meristem culture. Scientia Horticulturae，2009，119:108-112.

10 Zha FF(査芳芳)，et al.HPLC Fingerprinting of Huangshan Gongju Chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium Ramat.).Food Sci (食品科學(xué))，2011，20:146-150.

11 Xu WB(徐文斌)，Guo QS (郭巧生)，Li YN (李彥農(nóng))，et al.Comparative study on internal quality of various Chrysanthemum morifolium.Chin J Chin Mater Med (中國中藥雜志)，2005，30:1645-1648.