廖 怡，榮永海，榮 龍

北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京100191

蚯蚓又稱地龍，屬寡毛綱環(huán)節(jié)動(dòng)物門，在我國(guó)傳統(tǒng)中藥學(xué)中具有解熱、鎮(zhèn)痙、活絡(luò)、平喘等眾多藥理作用，蚯蚓入藥在我國(guó)已流傳千年。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，蚯蚓體內(nèi)含有豐富的活性成分，對(duì)蚯蚓的研究成為生物化學(xué)及藥物生物技術(shù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前，對(duì)于蚯蚓活性成分的研究主要集中在蚯蚓纖溶酶、抗腫瘤蛋白［1］、抗菌肽［2］等的提取純化與分析。其中，纖溶酶(俗稱蚓激酶)由于其特異的溶血栓功效，成為新一代溶栓藥物并成功應(yīng)用到西藥中。相關(guān)研究表明，蚯蚓體內(nèi)也含有豐富抗氧化酶類?？寡趸甘且活惥哂兄匾砉δ艿拿福鼈兡芗皶r(shí)清除體內(nèi)剩余的氧自由基，在治療疾病、延緩衰老等方面具有重要作用。如果從蚯蚓體內(nèi)有效提取出此類功能酶，并應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，這將拓寬蚯蚓的應(yīng)用范圍，對(duì)蚯蚓的綜合開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

目前，研究者們已從酵母、芽孢桿菌、重組大腸桿菌、黑曲霉等中分離純化出CAT，從細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、藻類、昆蟲(chóng)、魚(yú)類、植物和哺乳動(dòng)物等生物體內(nèi)純化得到SOD。但是這些研究都僅限于SOD或CAT 單個(gè)酶的分離純化，并未見(jiàn)兩酶聯(lián)合提取的報(bào)道。本研究使用閃式提取技術(shù)及羧甲基纖維素(CM-22)離子交換層析從蚯蚓中聯(lián)合提取SOD 和CAT，并通過(guò)柱層析等手段對(duì)蚯蚓SOD、CAT 進(jìn)行純化。聯(lián)合提取方法的建立不僅節(jié)約了資源、提高了原料利用率，也拓寬了蚯蚓的應(yīng)用范圍、為蚯蚓多種活性成分的綜合開(kāi)發(fā)利用創(chuàng)造了條件，為產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用赤子愛(ài)勝蚯蚓(Eisenia fetida)由天津蚓福生物科技開(kāi)發(fā)有限公司提供;羧甲基纖維素CM-22(Carboxymethyl Cellulose，CM)購(gòu)自英國(guó)Whatman公司;二乙胺基乙基纖維素(DEAE-Cellulose)購(gòu)自上海試劑二廠;葡聚糖凝膠G-200(Sephadex G-200)、葡聚糖凝膠G-75(Sephadex G-75)購(gòu)自美國(guó)Pharmacia 公司;SOD 活性檢測(cè)用鄰苯三酚購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;CAT 活性檢測(cè)用鉬酸銨購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;蛋白檢測(cè)用考馬斯亮藍(lán)G-250 購(gòu)自美國(guó)Amresco 公司:電泳試劑盒購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司;SOD 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司;CAT 標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Serva公司;其余試劑均從北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司購(gòu)買;全部試劑均為分析純或色譜純等級(jí);所有溶液均以雙蒸水配制而成。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SP-756P 型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;ArantiTMJ-25 型低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter 公司;FC-95A 自動(dòng)餾分收集器，北京新技術(shù)應(yīng)用研究所;蛋白分離純化層析柱，上海錦華層析設(shè)備廠;JHBE-50S 型閃式提取器，北京金鼐科技發(fā)展有限公司;868 型酸度計(jì)，美國(guó)Orion 公司;雙蒸水過(guò)濾器，美國(guó)PALL 公司。

1.3 方法

1.3.1 蚯蚓的預(yù)處理

取270 g 新鮮冷凍蚯蚓(已洗凈)平均分為3份，剪碎，每份以1 ∶4(m/V)的比例加入已預(yù)冷的2.5 mmol/L pH 7.0 磷酸緩沖液中。分別用閃式提取(轉(zhuǎn)速5500 rpm，提取4 次，每次30 s，每次間歇5 min)、超聲波提取(組織搗碎后超聲波提取2 次，功率800 W，每次30 min)和組織均漿(2 次，每次1.5 min)進(jìn)行提取。提取完成后，檢測(cè)SOD 和CAT 的活性，置于-20 ℃冰箱冷凍12 h，取出融化，11000 ×g 4 ℃離心1 h，收集上清液即為SOD、CAT 粗提液。

1.3.2 SOD、CAT 粗品的分離

CM-22 離子交換柱填料按說(shuō)明處理，裝柱后用0.05 mol/L pH 5.0 醋酸緩沖液平衡。粗提液用pH酸度計(jì)調(diào)pH 5.0，11000 ×g 4 ℃離心30 min，收集上清液，上清液上CM-22 柱(2.5 cm × 45 cm)，流速2 mL/min，收集未吸附上CM-22 柱的酶液即為SOD 粗提液，測(cè)定SOD 活性;CM-22 柱吸附酶液用0.05 mol/L pH 6.0 磷酸緩沖液洗脫，流速1 mL/min，收集洗脫液即為CAT 粗提液，測(cè)定CAT 活性，用2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液4 ℃透析12 h。

1.3.3 CAT 的純化

1.3.3.1 Sephadex G-200

透析后的CAT 粗提液用PEG-4000 濃縮，濃縮液上Sephadex G-200 柱(2.6 cm × 70 cm，填料按說(shuō)明充分溶脹)，2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液進(jìn)行平衡和洗脫，流速2.5 mL/h，每管收集5 mL。測(cè)定每管CAT 活性和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的各管酶液，進(jìn)行下一步純化。

1.3.3.2 DEAE-Cellulose

DEAE-Cellulose 離子交換柱填料按說(shuō)明處理，裝柱后用2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液平衡。G-200 收集的CAT 粗提液上DEAE-Cellulose 柱(1.6 cm × 30 cm)，0.05 mol/L NaCl 溶液進(jìn)行洗脫［3］，流速1 mL/min，收集洗脫液即為CAT 酶液。

1.3.4 SOD 的純化

1.3.4.1 丙酮沉淀

將SOD 粗提液按1∶1(V/V)進(jìn)行丙酮沉淀［4］，置于-20 ℃15 min 后離心，11000 × g 4 ℃離心30 min，棄去上清，沉淀用2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液溶解，測(cè)定SOD 活性，2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液4 ℃透析12 h。

1.3.4.2 DEAE-Cellulose

DEAE-Cellulose 裝柱后用2.5 mmol/L pH 7.6磷酸緩沖液平衡。透析后的SOD 酶液上DEAE-Cellulose 柱(1.6 cm × 30 cm)，5 mmol/L～200 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液進(jìn)行梯度洗脫［4］，流速20 mL/h，每管收集5 mL。測(cè)定每管SOD 活性和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的各管酶液，2.5 mmol/L pH 7.6磷酸緩沖液4 ℃透析12 h。

1.3.4.3 Sephadex G-75

透析后的SOD 酶液用PEG-4000 濃縮后上Sephadex G-75 柱(1.6 cm × 80 cm，填料按說(shuō)明充分溶脹)，流速20 mL/h，每管收集5 mL。測(cè)定每管SOD 活性和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的各管酶液，得到蚯蚓SOD 純品。

1.3.5 蚯蚓SOD、CAT 提取和純化總工藝

1.3.6 SOD 活性測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD 活性，參考文獻(xiàn)［5］，略有改進(jìn)。以每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率50%所需的酶量為1 個(gè)酶活單位。

1.3.7 CAT 活性測(cè)定

［6］略有改動(dòng)，以過(guò)氧化氫為底物，采用鉬酸銨終止法進(jìn)行測(cè)定。以每分鐘催化分解1 μmol 過(guò)氧化氫所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位。

1.3.8 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定［7］，以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)品繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.9 SOD 純度鑒定及亞基分子量的測(cè)定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行SOD 的純度鑒定并測(cè)定其亞基分子量，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%。

1.3.10 CAT 活性染色、純度鑒定及分子量的測(cè)定

參考董泗建等［8］的方法，略有改進(jìn)，對(duì)CAT 進(jìn)行活性染色。采用native-PAGE 進(jìn)行CAT 的純度鑒定，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定其亞基分子量，分離膠和濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%、5%。

1.3.11 熱穩(wěn)定性

在含0. 05 mol/L pH 7. 0 磷酸緩沖液中，將SOD、CAT 酶液分別至于25、35、45、55、65、75 ℃水中，水浴30 min，測(cè)定酶活性。

1.3.12 pH 值穩(wěn)定性

將SOD、CAT 酶液分別置于0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 3-8)、0.05 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9-10)、0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 11-12)中，經(jīng)40 min 后分別測(cè)定其酶活性。

1.3.13 最適pH 值

將CAT 酶液置于用0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 3-8)、0.05 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9-10)、0.05 mol/L 磷酸氫二鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 11)配置成的0.05 mol/LH2O2中反應(yīng)，計(jì)算反應(yīng)后酶活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蚯蚓SOD、CAT 粗品提取及分離

在此前的研究中，我們采用閃式提取法對(duì)羅漢果多酚［9］、羅漢果甜甙［10］、柑橘檸檬苦素［11］等生物活性成分進(jìn)行提取，提取效率均高于傳統(tǒng)提取方法。本研究將閃式提取法與超聲波提取法、組織勻漿提取法等傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，結(jié)果如表1 所示，閃式提取法具有最高的蚯蚓CAT 收率，超聲波提取蚯蚓SOD 的收率略高于閃式提取。但是由于完成一次超聲波提取的時(shí)間為1 h，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于閃式提取法所需的2 min，從活性收率和節(jié)能高效方面綜合考慮，本研究采用閃式提取法對(duì)蚯蚓SOD、CAT 進(jìn)行提取。

表1 不同提取方法酶收率的比較Table 1 Comparison of extraction methods

閃式提取之后的SOD、CAT 粗提液冷凍過(guò)夜，融化，測(cè)定粗提取液中SOD、CAT 的活性及比活(表2、表3)。粗提液上CM-22 柱，對(duì)SOD、CAT 進(jìn)行分離，CM-22 柱未吸附溶液為SOD 粗提液，酶活性回收率為88.23%(表3)，CM-22 柱吸附后洗脫溶液為CAT 粗提液，酶活性回收率為69.5%(表2)，CM-22離子交換層析柱對(duì)SOD、CAT 具有良好的分離效果。

2.2 蚯蚓CAT 的純化

CAT 粗提液經(jīng)Sephadex G-200 凝膠過(guò)濾層析后，結(jié)果如圖2 所示，收集活性高峰，得到比活6903 U/mg 的蚯蚓CAT。收集后的溶液上平衡好的DEAE-Cellulose 柱，得到比活22606 U/mg 的蚯蚓CAT。純化后的蚯蚓CAT 活性高于市售黑曲霉CAT(≥4000 U/mg protein，Sigma-Aldrich Co.，USA)，牛肝CAT(2000～5000 U/mg protein，Sigma-Aldrich Co.，USA)，但是與人紅細(xì)胞CAT(≥30000 U/mg protein，≥90%電泳純，Sigma-Aldrich Co.，USA)相比還有一定差距。

圖2 蚯蚓CAT 的G-200 洗脫曲線Fig.2 Separation of earthworm CAT on Sephadex G-200 column

表2 蚯蚓CAT 純化結(jié)果Table 2 Purification of earthworm CAT

2.3 蚯蚓CAT 的活性染色、純度鑒定及分子量的測(cè)定

純化后的CAT 用native-PAGE 鑒定純度，最終顯示2 條主帶。用鐵染色法對(duì)非變性電泳條帶進(jìn)行活性染色，染色結(jié)果表明，分子量較大的主帶具有CAT 活性，并且與牛肝CAT 其中一條CAT 酶帶對(duì)應(yīng)(圖3)，分子量較小的主帶不具有CAT 活性，分析其原因可能是:1.在純化過(guò)程中此分子量的CAT失活;2.此條帶蛋白為雜蛋白。此蛋白的特征還有待進(jìn)一步探究。此外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，過(guò)氧化氫酶在生物體內(nèi)形態(tài)多樣，如蘋果含1 種CAT［3］，而嗜溫性沙雷氏菌則含3 種不同分子量CAT［12］，因此本研究提取出的蚯蚓CAT 可能只是蚯蚓體內(nèi)其中的一種CAT 活性組分。

通過(guò)SDS-PAGE 測(cè)得此CAT 亞基分子量約為72 kD，而CAT 由4 個(gè)相同亞基組成，據(jù)此推測(cè)本研究提取出的蚯蚓CAT 分子量約為288 kD，這與Switala［13］等的研究相符(CAT 分子量一般為220～340 kD)。

圖3 蚯蚓CAT 的活性染色，非變性電泳和SDS 變性凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Active staining of purified earthworm CAT，Native-PAGE and SDS-PAGE analysis

2.4 蚯蚓SOD 的純化

經(jīng)離子交換層析柱CM-22 分離后的SOD 粗提液按1∶1(V/V)進(jìn)行丙酮沉淀，如表2 所示，沉淀溶解后測(cè)得其比活為645.5 U/mg(表2)，將溶液透析12 h。透析后的溶液上DEAE-Cellulose 離子交換層析柱，結(jié)果如圖4 所示，收集活性峰，得到比活3532 U/mg 的SOD 酶液(表3)。經(jīng)DEAE-Cellulose 純化后的SOD 酶液用2.5 mmol/L pH 7.6 磷酸緩沖液在4 ℃條件下透析12 h，濃縮后上Sepahdex G-75 凝膠過(guò)濾層析柱，結(jié)果如圖5 所示，收集活性峰，最終得到比活9352 U/mg 的SOD 純品，活性回收率為18.44%(表3)。純化的蚯蚓SOD 比活高于市售牛紅細(xì)胞SOD 標(biāo)準(zhǔn)品(2500～7000 U/mg，Sigma-Aldrich Co.，USA)，并且高于大部分文獻(xiàn)報(bào)道［4，14-18］。

圖4 蚯蚓SOD 的DEAE-Cellulose 洗脫曲線Fig.4 Separation of earthworm SOD on DEAE-Cellulose column

圖5 蚯蚓SOD 的G-75 洗脫曲線Fig.5 Separation of earthworm SOD on Sephadex G-75 column

表3 蚯蚓SOD 的純化結(jié)果Table 3 Purification of earthworm SOD

2.5 蚯蚓SOD 純度鑒定及亞基分子量的測(cè)定

純化后的蚯蚓SOD 經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后為單一條帶，測(cè)得其亞基分子量約為17 kD，與SOD 標(biāo)準(zhǔn)品(Bovine erythrocytes，亞基分子量16.3 kD，全酶分子量32.5 kD)相似(圖6)。

圖6 蚯蚓SOD 的SDS 變性凝集電泳Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified earthworm SOD

2.6 蚯蚓SOD 的穩(wěn)定性

2.6.1 SOD 的熱穩(wěn)定性

結(jié)果如圖7 所示，蚯蚓SOD 酶活性在45 ℃時(shí)最高，在35 ℃～55 ℃之間具有較好的熱穩(wěn)定性，與文獻(xiàn)報(bào)道相似(表4)，75 ℃時(shí)酶活力幾乎完全喪失。

圖7 蚯蚓SOD 的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of earthworm SOD

2.6.2 SOD 的pH 值穩(wěn)定性

結(jié)果如圖8 所示，蚯蚓SOD 的pH 值耐受范圍較廣，在pH 4～11 之間具有良好的穩(wěn)定性，與南瓜、大蒜相似，優(yōu)于紫草籽、黑豆來(lái)源的SOD 相似(表4)。當(dāng)pH 值為3 時(shí)，SOD 幾乎完全失活。因此，我們?cè)隍球維OD 的提取及檢測(cè)過(guò)程中，pH 值始終保持在4～11 之間，以防止酶活性的丟失。

圖8 蚯蚓SOD 的pH 值穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of earthworm SOD

表4 蚯蚓SOD 與其他來(lái)源SOD 的穩(wěn)定性比較Table 4 Comparison of SOD ability

2.7 蚯蚓CAT 的穩(wěn)定性

2.7.1 CAT 的熱穩(wěn)定性

結(jié)果如圖9 所示，不同于蚯蚓SOD 的是，CAT酶活性在35 ℃時(shí)最高，與貽貝、鴨肝來(lái)源的CAT 相似(表5)，在25 ℃～45 ℃之間具有較好的熱穩(wěn)定性，65 ℃時(shí)酶活力幾乎完全喪失。結(jié)果表明，蚯蚓SOD 比CAT 具有更好的熱穩(wěn)定性。

圖9 蚯蚓CAT 的熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stability of earthworm CAT

2.7.2 CAT 的pH 穩(wěn)定性

結(jié)果如圖10 所示，蚯蚓CAT 的pH 值耐受范圍較廣，在pH 4～10 之間具有良好的穩(wěn)定性，優(yōu)于韭菜和粘質(zhì)沙雷氏菌(表5)。我們?cè)隍球綜AT 的提取及檢測(cè)過(guò)程中，pH 值保持在4～10 之間，以防止酶活性的大量丟失。蚯蚓SOD 和CAT 較廣的pH值耐受范圍，預(yù)示了其在實(shí)際應(yīng)用中較強(qiáng)的pH 值適應(yīng)性，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

表5 蚯蚓CAT 與其他來(lái)源CAT 穩(wěn)定性的比較Table 5 Comparison of CAT ability

2.7.3 CAT 的最適pH 值

蚯蚓CAT 的最適反應(yīng)pH 值為6，與蘆薈、蘋果來(lái)源的CAT 具有一定差異(表5)，當(dāng)pH 值小于4或大于11 時(shí)，相對(duì)酶活性下降至50%以下。所以，蚯蚓CAT 的最適pH 值為6～7 之間，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中檢測(cè)CAT 酶活性時(shí)pH 值控制在6～7。

蚯蚓SOD、CAT 性質(zhì)的測(cè)定為實(shí)驗(yàn)中有效保持酶的活性、采用最佳提取及檢測(cè)條件提供了依據(jù)。此外，不同來(lái)源SOD、CAT 在性質(zhì)上的差異也顯示出蛋白酶由于生物體環(huán)境不同而具有的生物多樣性。

3 結(jié)論

在本研究中，我們首次利用閃式提取技術(shù)使得CAT 的提取效率比傳統(tǒng)超聲波提取和組織勻漿提取分別提高14.4%、44.4%，SOD 的提取效率與組織勻漿法相比提高32.5%。閃式提取技術(shù)為蚯蚓的分離提取提供了一種高效的方法。同時(shí)也為蚯蚓體內(nèi)其它活性成分(谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶等)的充分開(kāi)發(fā)利用創(chuàng)造了條件。

利用柱層析等方法對(duì)蚯蚓SOD、CAT 進(jìn)行分離純化，收率分別達(dá)到18.44%和14.98%，得到比活9352 U/mg 的SOD，CAT 比活也達(dá)到22606 U/mg，分離純化效果良好。本研究成功實(shí)現(xiàn)了蚯蚓SOD、CAT 的聯(lián)合提取，不僅拓寬了抗氧化酶的生物來(lái)源，還提高了蚯蚓利用率，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍，使蚯蚓的綜合利用具有更好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

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