沈 瀟，孫曉紅* ，趙 勇，謝慶超，吳啟華，潘迎捷

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306;2 美國緬因大學(xué)食品科學(xué)與人類營養(yǎng)系，緬因04469

藍莓又稱越橘、藍漿果，是一種極耐寒的野生植物。其果實不僅肉質(zhì)細膩、酸甜適中，而且營養(yǎng)豐富，因此被譽為“漿果之王”。果實中最具吸引力的營養(yǎng)成分當數(shù)其中含量豐富的酚類物質(zhì)，研究表明，藍莓中的酚類物質(zhì)具有抑菌、抗炎［1］、抗癌［2］等活性，而且在相應(yīng)的抑制濃度下不影響動物體細胞的正常生長［3］。有報道指出，藍莓中的酚類物質(zhì)能顯著降低菌體細胞對腸道上皮組織的粘附性［4］。陳玉峰等研究表明藍莓能抑制大腸桿菌的生長，且抑菌效果隨色素濃度的增加而增強［5］。

金黃色葡萄球菌是引起細菌性食物中毒的重要致病菌之一，主要通過食品傳播。據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心的統(tǒng)計，金黃色葡萄球菌在引起食物中毒的病原菌中占第2 位［6］。相關(guān)報道顯示［7］，2003～2007 年深圳市南山區(qū)274 起細菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒事件比率為14.2%?？股厥侵委熃瘘S色葡萄球菌感染的常見方法，但此方法使金黃色葡萄球菌的耐藥性增長迅速，大部分抗生素已難以抑制其生長［8］。

植物體內(nèi)富含生物活性化合物，其中大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)具有抑菌活性。而天然的抑菌劑相對于合成的化合物來說更加安全和健康，所以現(xiàn)在很多天然產(chǎn)物被廣泛關(guān)注，并用來預(yù)防和治療由細菌引起的各種疾?。?］。本研究選取四種在我國栽培時間長、遺傳性狀穩(wěn)定且產(chǎn)量高的藍莓代表種為原料，研究其對金黃色葡萄球菌的抑制效果，為今后藍莓抑菌活性物質(zhì)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

藍莓:Elliott、Darrow、Bluecrop 和Duke 均由青島沃林農(nóng)業(yè)公司提供，四種藍莓屬北高叢藍莓(Highbush Blueberry)。金黃色葡萄球菌(AB91093)購自上海疾病預(yù)防與控制中心。沒食子酸、無水乙醇，乙酸乙酯，鹽酸均購于國藥集團藥業(yè)股份有限公司。ODS-A C18 填料購于北京金歐亞科技有限公司。胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購于北京陸橋技術(shù)有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 藍莓提取物的制備

取四個品種的冷凍藍莓，進行微波加熱并快速解凍，洗凈原料，使用均質(zhì)機充分攪碎，稱取20.0 g藍莓漿置于200 mL 75%乙醇中，于室溫超聲粉碎30 min，過濾，濾液于4000 rpm 離心20 min，取上清液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待乙醇揮發(fā)完全后，將上清液濃縮至2 g/mL，總體積為10 mL，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藍莓對金黃色葡萄球菌的抑菌活性測定

將四種藍莓提取物分別用滅菌胰蛋白胨肉湯(TSB)配制為以下濃度:900，450，225，112. 5 mg/mL，每支試管總體積為2 mL，取10 μL 5 logCFU/mL金黃色葡萄球菌菌液依次接入相應(yīng)濃度的藍莓提取物中。同時，根據(jù)FDA 的相關(guān)標準［10］，將山梨酸鉀用無菌TSB 稀釋至2 mL，使其最終濃度為2 mg/mL。取10 μL 含有約5logCFU/mL 的金黃色葡萄球菌菌液接入試管中。用1 mL 的無菌水代替藍莓提取液作為對照組，操作同上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用平板計數(shù)法進行計數(shù)。

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

將四種藍莓提取物與山梨酸鉀用滅菌TSB 分別配制2 mL 的濃度為:100，200，300，350，400，600，800 和1080 mg/mL 的溶液，分別接入10 μL 含有5logCFU/mL 的金黃色葡萄球菌。對照組取1 mL 無菌水代替藍莓提取物加入1 mL TSB 中，加入10 μL含有約5logCFU/mL 菌液并于37 ℃培養(yǎng)24 h，用平板計數(shù)法進行計數(shù)。

1.2.4 藍莓中總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu 法測定藍莓中總酚酸含量［11］。準確吸取0.1 mL 樣品液于100 mL 容量瓶中，加50 mL 蒸餾水，再加入4 mL Folin-Ciocalteu 試劑搖勻，靜置5 min，加入8 mL 10% Na2CO3，蒸餾水定容，置于25 ℃的恒溫水浴鍋中2 h，顯色后于最大波長下測定吸光度，由標準曲線查得相對應(yīng)的濃度，并按下列公式計算多酚含量。

式中，ω 為多酚含量(mg /g);C 為沒食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL);V 為提取液體積(mL);N 為稀釋倍數(shù);M 為取樣量(g)。

1.2.5 藍莓中還原糖含量測定

藍莓中的還原糖含量采用國標法［12］進行測定。吸取5.0 mL 堿性酒石酸銅甲液與5.0 mL 酒石酸銅乙液于150 mL 錐形瓶中，加水10 mL，加入兩粒玻璃珠，從滴定管中加比預(yù)測體積少1mL 的試樣溶液至錐形瓶中，使其在2 min 內(nèi)加熱煮沸，保持沸騰繼續(xù)以1 滴/2s 的速度滴定，直至藍色剛好褪去為終點，記錄樣液消耗體積，平行測定3 次，得出平均消耗體積。

式中，χ 為試樣中還原糖含量(以葡萄糖計)，單位為g/100g;m1為堿性酒石酸銅溶液(甲、乙液各半)相當于某種還原糖的質(zhì)量，單位為mg;m 為試樣質(zhì)量，單位為g;V 為測定時，平均消耗的試樣溶液體積，單位為mL。

1.2.6 酚類物質(zhì)抑菌活性測定

參照吳啟華等［13］方法，對藍莓提取物進行純化。各取1 mL 濃度為1 g/mL 的四種藍莓提取物加入C18反相柱中，以1% HCl 水溶液除去藍莓中的糖分和有機酸。再用乙酸乙酯對藍莓中的酚類物質(zhì)進行洗脫，并收集洗脫液于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙酸乙酯，將濃縮后的酚酸溶于3 mL 無菌水中，置于-20℃保存?zhèn)溆谩⒄?.2.4 中總酚測定方法，對其中酚類物質(zhì)的含量進行測定。

將四種藍莓用無菌TSB 分別配制成2 mL 的濃度為0.2 mg/g 的溶液，用無菌移液器吸取10 μL 5 log CFU/mL 金黃色葡萄球菌菌液，依次接入相應(yīng)的藍莓液中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，用平板計數(shù)法計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓對金黃色葡萄球菌的抑制效果

四種藍莓提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果見表1。四種藍莓提取物對金黃色葡萄球菌均有抑制作用。其中，Elliott 和Darrow 對其抑制效果明顯強于Bluecrop 和Duke。當藍莓濃度達到450 mg/mL 時，Elliott 和Darrow 能完全殺死金黃色葡萄球菌。而Duke 和Bluecrop 在450 mg/mL 時，對細菌生長抑制效果不明顯。當四種藍莓濃度達到900 mg/mL 時，均未檢測到金黃色葡萄球菌。山梨酸鉀溶液在2 mg/mL 時，不能抑制金黃色葡萄球菌的生長。

表1 四種藍莓對金黃色葡萄球菌的抑菌效果(n=6，±s)Table 1 The antimicrobial effects of four blueberry extracts (n=6，±s)

表1 四種藍莓對金黃色葡萄球菌的抑菌效果(n=6，±s)Table 1 The antimicrobial effects of four blueberry extracts (n=6，±s)

注:a 表示經(jīng)24 h 培養(yǎng)后，處理組菌落總數(shù)和對照組菌落總數(shù)有顯著性差異(p ＜0.05)。Note:a Represents a significant (P ＜0.05)difference from control at 24 h(p ＜0.05).

藍莓品種Blueberries濃度Concentrations(mg/mL)菌落總數(shù)Colong-Forming Onits(log CFU/mL)0 h 24 h對照Control 0 5.27 ±0.66 7.79 ±0.38山梨酸鉀Potassium sorbate 2 5.27 ±0.66 9.13 ±0.15a杜克Duke 112.5 6.00 ±0.060 8.68 ±0.39 225 5.89 ±0.029 7.31 ±0.30 450 6.05 ±0.12 7.08 ±0.035 900 5.96 ±0.09 6.11 ±0.24a達柔Darrow 112.5 6.06 ±0.60 7.42 ±0.30 225 5.95 ±0.47 7.40 ±0.48 450 6.16 ±0.58 0.00a 900 5.57 ±0.43 0.00a埃利奧特Elliott 112.5 6.00 ±0.44 7.52 ±0.43 225 5.79 ±0.62 6.53 ±0.52a 450 5.41 ±0.33 0.00a 900 5.68 ±0.49 0.00a藍豐Bluecrop 112.5 5.95 ±0.40 8.38 ±0.37 225 5.98 ±0.46 8.20 ±0.37 450 5.91 ±0.88 7.56 ±0.45 900 5.81 ±0.49 0.00 a

2.2 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

四種藍莓提取物和山梨酸鉀溶液對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度見表2。

表2 四種藍莓提取物及山梨酸鉀溶液對金黃色葡萄球菌的MIC 及MBC 測定結(jié)果Table 2 The MIC and MBC of different blueberry extracts and potassium sorbate

由表可見，四種藍莓提取物中，Elliott 提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果最強。

2.3 藍莓中總酚酸和還原糖含量的測定

藍莓提取物中總酚酸和還原糖含量的含量見表3。其中，Darrow 中總酚酸含量最高，達到1.99 mg/g。Duke 中總酚酸含量最低，僅為1.32 mg/mL。四種藍莓中，Elliott 中還原糖的含量最低，而Duke 中還原糖含量最高，達191.90 mg/mL。

表3 四種藍莓中總酚酸與還原糖含量Table 3 The content of total phenolic and reducing sugar of different blueberry extracts

2.4 酚類物質(zhì)對金黃色葡萄球菌的抑制作用

表4 顯示四種藍莓經(jīng)分離純化之后獲得的酚類物質(zhì)中總酚含量。其中，Darrow 中總酚酸含量最高，達到0.46 mg/g，Elliott 中總酚含量次之，Duke中總酚含量最低。圖1 顯示，藍莓中酚類物質(zhì)具有明顯的抑菌活性。在0.2 mg/g 的濃度下，酚類物質(zhì)均能有效殺死金黃色葡萄球菌。

3 討論

藍莓味道鮮美、營養(yǎng)豐富，更因其突出的生理活性而備受關(guān)注。本研究中四種藍莓提取物均能顯著抑制金黃色葡萄球菌的生長。其中，Elliott(300 mg/mL)和Darrow(350 mg/mL)對金黃色葡萄球菌的抑菌效果尤為顯著，均能在低濃度時抑制金黃色葡萄球菌的生長。Bluecrop 和Duke 對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用明顯弱于Elliott 和Darrow。同時，經(jīng)純化所得的藍莓酚類物質(zhì)在0.2 mg/mL 時，均對金黃色葡萄球菌顯示出顯著的抑菌效果。和粗提物的抑菌效果相比較，發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)的抑菌活性更強，在0.2 mg/mL 的濃度下就可完全殺滅金黃色葡萄球菌。藍莓粗提物和酚類物質(zhì)間抑菌效果的差別可能與其所含成分的復(fù)雜程度有關(guān)。藍莓粗提物中所含成分較多，物質(zhì)間較易發(fā)生協(xié)同或拮抗作用，從而影響藍莓的抑菌效果，使其抑菌活力增強或減弱。而藍莓酚類物質(zhì)中成分相對簡單，物質(zhì)間的相互作用較少，酚類物質(zhì)更能顯示其抑菌活性。研究結(jié)果所示，藍莓中的酚類物質(zhì)能為藍莓的抑菌活性提供了幫助。

表4 四種酚類物質(zhì)中總酚酸含量Table 4 The content of total phenolic acid of different phenolic compounds

圖1 四種酚類物質(zhì)對金黃色葡萄球菌的抑制活性測定Fig.1 The antimicrobial effect of phenolic compounds against S.aureus

藍莓是酚類物質(zhì)的良好來源，具有提高機體免疫力，延緩衰老抗癌等多種生理活性功能［12，13］。本研究不僅研究了藍莓的抑菌效果，還測定了四種藍莓中總酚酸和還原糖的含量，發(fā)現(xiàn)Darrow 和Elliott粗提物中酚酸的含量明顯高于另外兩種藍莓，分別達到1.99 mg/mL(Darrow)和1.75 mg/mL(Elliott)。同時，通過測定純化后的藍莓提取物中總酚含量，實驗結(jié)果顯示Darrow 中總酚含量最高，Elliott 中總酚含量次之，而Bluecrop 和Duke 中總酚含量相近。而Darrow 和Elliott 中還原糖含量卻明顯低于Bluecrop和Duke。研究結(jié)果表明，藍莓中所含的酚酸和還原糖含量因品種不同而具有顯著差異，且其抑菌活性和酚酸、還原糖的含量有緊密聯(lián)系。酚酸是一類苯環(huán)上有若干個酚羥基的化合物，其所帶有的酚羥基能破壞細菌的細胞膜，使細菌內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，并可抑制微生物細胞的呼吸酶系與電子傳遞酶系的活性，從而殺死細菌。故酚酸含量越高，酚羥基的數(shù)目也越多，對細菌細胞膜的破壞作用就越強，抑菌效果越明顯。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)Elliott 的抑菌效果明顯強于Darrow 的抑菌效果，但Elliott 中總酚酸的含量卻低于Duarrow 中總酚酸的含量。在植物體內(nèi)酚往往不單是以游離形式存在的，而通過縮醛鍵與還原糖結(jié)合存在，形成糖苷。糖苷在堿性條件下穩(wěn)定，遇酸易水解。酚酸類物質(zhì)以糖苷形式存在于藍莓中，更容易維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而保護其抑菌活性不受外界環(huán)境干擾。在四種藍莓中，雖然Elliott 中總酚酸的含量低于Darrow 中總酚的含量，但是其所含還原糖含量比Darrow 低，這說明在Elliott 中更多的酚酸類物質(zhì)能和游離狀態(tài)的還原糖生成糖苷類，從而有效保證藍莓的抑菌活性不受外界環(huán)境干擾。通過本研究可得出結(jié)論，藍莓抑菌能力和酚含量呈正相關(guān)，而與還原糖含量呈負相關(guān)。

山梨酸鉀抑菌活性實驗的測定結(jié)果顯示，山梨酸鉀在低濃度時對金黃色葡萄球菌無抑菌作用，只有在濃度達到100 mg/mL 時方可抑制金黃色葡萄球菌的生長。雖然，山梨酸鉀溶液可被人體代謝系統(tǒng)吸收，迅速分解成二氧化碳和水，對人體無毒害，是目前使用最為廣泛的抑菌劑，但FDA/WHO 嚴格規(guī)定其在食品中所能使用的最大劑量不能超過2 g/kg。本實驗中，山梨酸鉀溶液對金黃色葡萄球菌的MIC 已達100 mg/mL，遠超過FDA/WHO 所規(guī)定山梨酸鉀的最大使用劑量。由此可見，山梨酸鉀溶液對金黃色葡萄球菌生長的抑制效果不如藍莓提取物。

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