蒲秀瑛 ，李 言，張偉杰，王恒瑞，王 鵬

蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730050

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸 (Angelica sinensis(Oliv.)Diels )的干燥根，是臨床常用藥，一般認(rèn)為其味辛，而性微溫，歸心、肝、脾三經(jīng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)一步證明了當(dāng)歸活血化瘀、補(bǔ)血止痛等作用，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸有抗炎、清除氧自由基、保肝利膽、保護(hù)腎臟、增強(qiáng)免疫功能等作用［1，2］。黃芪是豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.Var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge. 的干燥的根，具有補(bǔ)氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功能［3］。多糖(polysaccharide)是一類(lèi)具有廣泛生物活性的生物大分子物質(zhì)，存在于近百種植物中，由于其生理活性強(qiáng)，細(xì)胞毒性低，毒副作用小，因此對(duì)植物多糖的研究已成為醫(yī)藥界的熱門(mén)領(lǐng)域［4］。

目前對(duì)各種中草藥中提取的多糖的藥理研究較多，當(dāng)歸和黃芪又是最常見(jiàn)的傳統(tǒng)中藥，且當(dāng)歸多糖與黃芪多糖分別為其重要活性化合物。本課題組研究表明，從一定比例的當(dāng)歸和黃芪中提取的歸芪多糖具有一定的抗氧化和保護(hù)肝損傷等作用［5，6］。本試驗(yàn)通過(guò)建立衰老小鼠模型，觀察歸芪多糖的延緩衰老作用及其作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)抗衰老天然藥物提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材

當(dāng)歸，黃芪:均購(gòu)自甘肅岷縣。藥材樣品分別經(jīng)甘肅省藥品檢驗(yàn)所鑒定為當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels 和膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥的根。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種SPF 級(jí)小鼠50 只，2 月齡，體重(30 ±5)g，雌雄各半，由蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(甘)2009-0004。

1.3 主要試劑和儀器

RE-5286A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司);ULTRA-TURRAX 378 型組織勻漿機(jī)(東莞市通用精工液壓機(jī)械工具廠);紫外分光光度計(jì)(南京麒麟分析儀器有限公司);MK3 型酶標(biāo)儀(成都一科儀器設(shè)備有限公司)。乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇(均為分析純)。維生素E 膠丸購(gòu)于廈門(mén)星鯊制藥有限公司(批號(hào)091110)，D-半乳糖購(gòu)于sigma 公司。過(guò)氧化氫測(cè)定(H2O2)試劑盒，批號(hào):20100809;蛋白質(zhì)測(cè)定(考馬斯亮藍(lán)法)試劑盒，批號(hào):20100725;谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)定(GSH-PX)試劑盒，批號(hào):20100728;黃嘌呤氧化酶(XOD)測(cè)定試劑盒，批號(hào):20100809;羥脯氨酸(Hyp)測(cè)定試劑盒，批號(hào):20100825 和單胺氧化酶(MAO)測(cè)定試劑盒，批號(hào):20100809;均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.4 歸芪多糖的制備

將當(dāng)歸與黃芪的混合物(1∶5)以10 倍量(體積質(zhì)量比)80%的乙醇回流提取2 次，每次2h;過(guò)濾得歸芪粗粉。歸芪粗粉中加入一定量的蒸餾水，加熱回流提取2 次，每次2 h，合并濾液，然后加適量95%乙醇，使乙醇終濃度為80%，過(guò)夜，抽濾，得歸芪多糖浸膏。用sevag 法除蛋白，在浸膏中加入正丁醇、氯仿混合溶液(正丁醇∶氯仿= 1∶5)，劇烈振搖20 min，離心，除去下層與交界處的變性蛋白，重復(fù)3～5 次;收集上層多糖溶液，減壓濃縮去除有機(jī)溶劑并得到歸芪多糖，測(cè)得其多糖含量為53.8%。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，雌雄各半，分別為正常對(duì)照組、衰老模型組、VitE 組、歸芪多糖高劑量組(1g/kg)、歸芪多糖低劑量組(0.5 g/kg)。除正常對(duì)照組外，其余各組每日頸背部皮下注射D-半乳糖(0.5 g/kg)，1 次/d，正常對(duì)照組注射同劑量的生理鹽水。從第8d 開(kāi)始，歸芪多糖高、低劑量組分別以1 和0.5 g · kg-1/d 的劑量灌胃，0.2 mL/次，1次/d，維生素E 組灌服0.1 g · kg-1/d 的維生素E溶液，0.2 mL/次，1 次/d，共計(jì)42 d。每日用剃毛器剃去所有小鼠背部被毛，暴露約2 cm×2 cm 的皮膚，歸芪多糖高劑量組(1 g/kg)和低劑量組(0.5 g/kg)分別以含30%甘油的歸芪多糖提取液擦拭背部皮膚，早晚各一次，共計(jì)42 d;其余各組以生理鹽水對(duì)背部皮膚進(jìn)行擦拭。

1.6 歸芪多糖對(duì)衰老小鼠血清中H2O2、肝組織中GSH-PX 和XOD 的測(cè)定

42 d 后，摘眼球取血后脫頸處死小鼠，分離血清，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定H2O2含量;同時(shí)摘取小鼠肝組織，低溫勻漿后加生理鹽水［肝重(g)/生理鹽水(mL)=1/9］，離心(4 ℃，2500 rpm ×30 min)后取上清，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定GSH-PX 和XOD的活力。

1.7 歸芪多糖對(duì)衰老小鼠腦組織中MAO 和皮膚羥脯氨酸含量的測(cè)定

取小鼠腦組織制成10%的組織勻漿，離心(4℃，2500 rpm)30 min 后取上清，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定MAO 活力;再分別取各組小鼠背部給藥部位皮膚，去毛及脂肪，用1∶1 丙酮-乙醚脫脂，切碎晾干，精密稱(chēng)取20 mg，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Hyp 含量的測(cè)定。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 歸芪多糖對(duì)衰老小鼠血清H2O2、肝組織GSHPX 活力和XOD 活力的影響

模型對(duì)照組與正常組相比，血清H2O2含量和肝組織XOD 活性明顯升高，GSH-PX 活性降低，說(shuō)明D-半乳糖致衰老小鼠模型造模成功，如表1 所示。

維生素E 和歸芪多糖均能降低衰老小鼠血清H2O2含量和肝組織XOD，活力差異極顯著(P ＜0.01)。且維生素E 與高低劑量歸芪多糖相比，無(wú)顯著性差異，提示高劑量歸芪多糖降低衰老小鼠血清H2O2含量和肝組織XOD 的作用與陽(yáng)性對(duì)照藥物維生素E 的作用類(lèi)似;而低劑量組H2O2含量和XOD的活力均低于維生素E 組的(P ＜0.05)，說(shuō)明歸芪多糖濃度越高，衰老模型小鼠血清H2O2含量和肝組織XOD 活力越低，抗衰老作用可能越強(qiáng)。

相比正常組，模型對(duì)照組肝組織GSH-PX 活性明顯降低，而經(jīng)維生素E 和歸芪多糖治療后GSHPX 活性明顯得到提高(P ＜0.01)，表明歸芪多糖可顯著提高衰老小鼠肝組織GSH-PX 的活性，且歸芪多糖高劑量組GSH-PX 活性與維生素E 組差異不顯著。

表1 歸芪多糖對(duì)衰老小鼠血清H2O2、肝組織GSH-PX 和XOD 活力的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of Guiqi Polysaccharides on H2O2of serum，GSH-PX and XOD of liver tissue in aging mice(±s，n=10)

表1 歸芪多糖對(duì)衰老小鼠血清H2O2、肝組織GSH-PX 和XOD 活力的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of Guiqi Polysaccharides on H2O2of serum，GSH-PX and XOD of liver tissue in aging mice(±s，n=10)

與衰老模型組相比:★P ＜0.05;★★P ＜0.01;與VitE 組相比:▲P ＜0.05;▲▲P ＜0.01Note:★P ＜0.05;★★P ＜0.01vs Aging Model;▲P ＜0.05;▲▲P ＜0.01 vs Vitamin E

組別Group H2O2 含量H2O2content(mmol·L-1)XOD 活力XOD activity(U· mgprot-1)GSH-PX 活力GSH-PX activity(U· mgprot-1·min)正常對(duì)照組Normal 127.73 ±11.94★★ 18.65 ±3.17★★ 160.94 ±12.97★★衰老模型組Aging Model 199.12 ±21.3 26.94 ±2.24 77.59 ±6.68維生素E 組Vitamin E 144.51 ±12.15★★ 21.11 ±1.95★★ 153.24 ±11.16★★歸芪多糖高劑量組Higher dose 148.04 ±15.01★★ 20.99 ±1.46★★ 142.11 ±10.30★★歸芪多糖低劑量組Lower dose 171.38 ± 17.16★▲ 22.20 ±3.07★ 91.99 ±7.92★★▲▲

2.2 歸芪多糖對(duì)衰老小鼠大腦MAO 和皮膚中Hyp含量的影響

研究結(jié)果顯示(見(jiàn)表2):衰老模型組小鼠腦組織中MAO 水平較正常對(duì)照組高，兩者間差異極顯著(P ＜0.01)。衰老模型小鼠經(jīng)歸芪多糖干預(yù)后，腦組織MAO 的活力有所降低(P ＜0.05;P ＜0.01)，說(shuō)明歸芪多糖可明顯降低衰老小鼠腦中MAO 的活力，并且隨多糖含量增高，效果愈加明顯。

同時(shí)顯示，歸芪多糖可顯著拮抗D-半乳糖的作用，不同劑量組(0.5 和1 g/kg)均能使皮膚組織中羥脯氨酸含量明顯回升(與模型組相比較)，且高劑量組略高于低劑量組，提示歸芪多糖提取物在改善小鼠皮膚膠原蛋白代謝、恢復(fù)衰老小鼠皮膚彈性方面具有一定的作用，且在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，藥物濃度越高，對(duì)小鼠皮膚抗衰老的作用可能越強(qiáng)。

表2 歸芪多糖對(duì)衰老小鼠腦中MAO 和皮膚中Hyp 含量的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of Guiqi Polysaccharides on the brain MAO and the skin Hyp of the aging mice(±s，n=10)

表2 歸芪多糖對(duì)衰老小鼠腦中MAO 和皮膚中Hyp 含量的影響(±s，n=10)Table 2 Effects of Guiqi Polysaccharides on the brain MAO and the skin Hyp of the aging mice(±s，n=10)

與衰老模型組相比:★P ＜0.05;★★P ＜0.01;與VitE 組相比:▲P ＜0.05;Note:★P ＜0.05;★★P ＜0.01vs Aging Model;▲P ＜0.05;▲P ＜0.05 vs Vitamin E

組別Group Hyp 含量Hyp content(ug · mg-1)MAO 活力MAO activity(U· mgprot-1)正常對(duì)照組Normal 1.67 ±0.28★★ 9.23 ±0.64★★衰老模型組Aging Model 1.24 ±0.16 11.12 ±0.95維生素E 組Vitamin E 1.54 ±0.18★★ 9.51 ±0.71★★歸芪多糖高劑量組Higher dose1.47 ±0.19★★ 9.85 ±0.77★★歸芪多糖低劑量組Lower dose1.33 ±0.15★▲ 10.38 ± 0.85★▲

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)D-半乳糖建立衰老小鼠模型，使小鼠全身代謝紊亂，脂質(zhì)過(guò)氧化亢進(jìn)，蛋白質(zhì)合成減少，造成神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和功能退化，另外，該模型動(dòng)物的多種組織細(xì)胞的病理變化也符合自然衰老時(shí)所出現(xiàn)的病理改變，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型具有一定的可靠性，故可用于抗衰老藥物研究。

維生素E 可保護(hù)多價(jià)的不飽和脂肪酸免受氧化破壞，預(yù)防和阻止誘發(fā)脂質(zhì)的過(guò)氧化，減少過(guò)氧化脂質(zhì)的生成，維持生物膜的正常結(jié)構(gòu)［7］。是公認(rèn)的具有抗衰老作用的一種抗氧化劑，因此，以維生素E 作為對(duì)照藥物來(lái)比較歸芪多糖的抗衰老作用。

自由基學(xué)說(shuō)［8，9］認(rèn)為自由基能引起細(xì)胞發(fā)生不可逆的損壞，導(dǎo)致細(xì)胞脆性增加、細(xì)胞斷裂、肌肉萎縮、記憶下降、智力減退，加速老化和衰老。從而增加有機(jī)體病變和死亡的可能性。因此，可以通過(guò)抑制或減少有機(jī)體組織中自由基的濃度而延長(zhǎng)有機(jī)體的壽命。

本研究結(jié)果顯示:模型對(duì)照組小鼠血清中H2O2顯著上升，提示H2O2的大量堆積使H2O2攻擊機(jī)體內(nèi)的生命大分子物質(zhì)及各種細(xì)胞器，加速機(jī)體的衰老進(jìn)程，可能是小鼠衰老的原因之一，而歸芪多糖可明顯降低D-半乳糖致衰老小鼠血清中H2O2含量，可能的原因是歸芪多糖提升了衰老小鼠血清中CAT(catalase，過(guò)氧化氫酶)的活力，CAT 清除自由基和H2O2，使H2O2含量降低，減少自由基對(duì)機(jī)體的損害。

GSH-PX 是有機(jī)體內(nèi)一個(gè)能夠幫助清除自由基的酶，人體隨著年齡的增長(zhǎng)，血清和組織中的GSHPX 的活性會(huì)下降［10］。而XOD 是體內(nèi)核酸代謝中一種重要的酶，當(dāng)組織缺血缺氧時(shí)，XOD 活性會(huì)大大提高并催化黃嘌呤氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的自由基，還可通過(guò)直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、激活產(chǎn)生氧化作用的炎癥細(xì)胞，對(duì)器官的氧化損傷和在相對(duì)防御功能薄弱的地方產(chǎn)生活性氧等直接造成組織損傷。

歸芪多糖作用于衰老小鼠后，其肝組織中GSHPX 的活性明顯升高，而XOD 的活性顯著減弱(P ＜0.01)，提示歸芪多糖可能通過(guò)提高小鼠肝組織中GSH-PX 的活性和降低XOD 的活性增強(qiáng)了機(jī)體清除自由基的能力，保證細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，延緩細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而起到一定的抗衰老作用。

單胺氧化酶(MAO)與衰老也是密切相關(guān)的，在正常肝、腎、大腦、腦于等區(qū)活動(dòng)性較強(qiáng)，可催化單胺氧化脫氨基，參與神經(jīng)元去甲腎上腺素、5-羥色胺等遞質(zhì)的分解［11］。

哺乳動(dòng)物及人類(lèi)皮膚的老化與膠原蛋白有著密切關(guān)系，而膠原蛋白組成中羥脯氨酸占12 %～14%，含量高且穩(wěn)定的羥脯氨酸成分是膠原蛋白的一大特點(diǎn)，因此可通過(guò)定量測(cè)定皮膚中膠原蛋白含量或直接測(cè)定羥脯氨酸含量作為皮膚衰老程度的指標(biāo)。

本研究顯示，不同劑量的歸芪多糖(0.5 和1 g/kg)可明顯抑制D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中MAO 活性的升高(P ＜0.01)，而MAO 活性下降有利于保持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，對(duì)機(jī)體的抗氧化及抗衰老有促進(jìn)作用。且能提高D-Gal 致衰老小鼠皮膚中的Hyp 含量(P ＜0.05，p ＜0.01)，減緩皮膚皺縮、松弛，提示其可能促進(jìn)膠原蛋白合成，起到抗皮膚衰老的功效。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用人工復(fù)制催老動(dòng)物模型的方法建立衰老小鼠，使衰老小鼠組織在功能上發(fā)生變化，再通過(guò)灌服不同劑量的歸芪多糖來(lái)研究歸芪多糖的抗衰老作用及機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):歸芪多糖通過(guò)降低小鼠血清H2O2含量，抑制腦組織MAO 和肝組織XOD活性，提高肝組織GSH-PX 活力及皮膚Hyp 的含量，來(lái)增強(qiáng)機(jī)體對(duì)自由基損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)能力，減輕自由基對(duì)生物大分子的攻擊，從而起到抗氧化和抗衰老的作用，這為進(jìn)一步研究抗衰老的藥物提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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