杜 平，曲 佳，畢麗萍

(1. 天津市傳染病醫(yī)院，天津 300192; 2.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

達(dá)原滴丸處方源于明代吳又可《瘟疫論》中的達(dá)原飲，由檳榔、厚樸、草果、芍藥、知母、黃芩、甘草組成，為開達(dá)膜原、避穢化濁之要方，主治瘟疫或瘧疾邪伏膜原之證。現(xiàn)代多應(yīng)用于病毒感染性發(fā)熱、濕熱發(fā)熱以及一些不明原因的高熱、盜汗、病毒性腦炎等［1］。達(dá)原滴丸是在達(dá)原飲方劑的基礎(chǔ)上研制出的中藥制劑，為了有效控制該制劑質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法鑒別處方中的白芍、知母、檳榔、厚樸及甘草;采用高效液相色譜法測(cè)定處方中芍藥苷的含量。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 SHIMADZU LC -2010AHT 高效液相色譜儀，儀器工作站:LC -Solution，色譜柱:phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱。

1.2 試藥 知母對(duì)照藥材(批號(hào)121070 -200804)、檳榔對(duì)照藥材(批號(hào)120915 -201011)、厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110729 - 200412)、和厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110730 - 200609)、甘草對(duì)照藥材(批號(hào)120904 -201016)、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736 -200933)均購自中國(guó)藥品生物制品檢定所;薄層層析用硅膠G 板(青島海洋化工廠)，乙腈、甲醇為色譜純，水為去離子水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白芍薄層鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取本品20 丸，研碎，加乙醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? ml 使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 ml 含1 mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方配比，取除白芍外的其他藥材，按工藝制成滴丸劑，再按“2.1.1”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 薄層條件及結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005 年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶ 5∶ 10∶ 0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 白芍TLC 色譜圖

2.2 知母薄層鑒別

2.2.1 供試品溶液制備 取本品20 丸，研碎，加乙醇20 ml，加熱回流40 min，濾過，取濾液10 ml，加鹽酸1 ml，加熱回流1 h 后濃縮至約5 ml，加水10 ml，用甲苯20 ml 振搖提取，提取液蒸干，殘?jiān)蛹妆? ml 使溶解，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液制備 取知母對(duì)照藥材2 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方配比，取除知母外的其他藥材，按工藝制成滴丸劑，再按“2.2.1”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 薄層條件及結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005 年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-丙酮(9∶ 1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無干擾。結(jié)果見圖2。

2.3 檳榔薄層鑒別

2.3.1 供試品溶液制備 取本品20 丸，研碎，加三氯甲烷20 ml 及濃氨試液3 ml ，超聲處理30 min，濾過，濾液加稀鹽酸10 ml、水20 ml，振搖，分取酸水層，加氨試液，調(diào)節(jié)pH 值至8 ～9 ，用三氯甲烷振搖提取2 次，每次10 ml，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 ml 使溶解，作為供試品溶液。

2.3.2 對(duì)照藥材溶液制備 取檳榔對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方配比，取除檳榔外的其他藥材，按工藝制成滴丸劑，再按“2.3.1”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.3.4 薄層條件及結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005 年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G 薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-甲醇(10∶ 4∶ 1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照溶液無干擾。結(jié)果見圖3。

2.4 厚樸薄層鑒別

2.4.1 供試品溶液制備 取本品20 丸，研碎，加甲醇20 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml 使溶解，作為供試品溶液。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 取厚樸酚對(duì)照品、和厚樸酚對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml 各含1 mg 的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

圖3 檳榔TLC 色譜圖

2.4.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方配比，取除厚樸外的其他藥材，按工藝制成滴丸劑，再按“2.4.1”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.4.4 薄層條件及結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005 年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-甲醇(27∶ 1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。結(jié)果見圖4。

圖4 厚樸TLC 色譜圖

2.5 甘草薄層鑒別

2.5.1 供試品溶液制備 取本品20 丸，加乙醚40 ml，加熱回流1 h，濾過，棄去醚液，藥渣加甲醇30 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 ml 使溶解，用正丁醇提取3 次，每次20 ml，合并正丁醇液，用水洗滌3 次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml 使溶解，作為供試品溶液。

2.5.2 對(duì)照藥材溶液制備 取甘草對(duì)照藥材1 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。

2.5.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方配比，取除甘草外的其他藥材，按工藝制成滴丸劑，再按“2.5.1”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.5.4 薄層條件及結(jié)果 照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2005 年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶ 1∶ 1∶ 2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光及紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)(見圖5A)或熒光斑點(diǎn)(見圖5B)。陰性對(duì)照溶液無干擾。

圖5 甘草TLC 色譜圖

2.6 白芍含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件 參照《中國(guó)藥典》2005 年版一部制定［2］。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-磷酸鹽緩沖液［0.067 mol/L磷酸氫二鈉-0.067 mol/L磷酸二氫鉀(5∶ 1)配制成pH 7.4 緩沖液］(15∶ 85)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.6.2 溶液制備

2.6.2.1 對(duì)照品溶液制備 取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含20 μg 的溶液，即得。

2.6.2.2 供試品溶液制備 取本品(批號(hào)D200601)適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理45 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方配制諸藥，取除白芍外的其他藥味，制成滴丸劑，再按“2.6.2.2”項(xiàng)下方法制成白芍陰性對(duì)照溶液。試驗(yàn)結(jié)果表明陰性對(duì)照溶液無干擾。依“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件，吸取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。

2.6.3 線性關(guān)系考查 取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含0.042 17 mg 的溶液，分別精密吸取1、2、5、7 和10 ml 置10 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得一系列對(duì)照品稀釋液。精密吸取上述系列對(duì)照品稀釋液5 μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品溶液濃度(mg/ ml)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果回歸方程為Y =2.448 2 ×106X + 6.330 7 ×102(r = 0.999 9)芍藥苷進(jìn)樣量在0.021 1 ～0.210 8 μg 之間，線性關(guān)系良好。

圖6 對(duì)照品(A)供試品(B)陰性對(duì)照(C)HPLC 色譜圖

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)D200601)6 份，按“2.6.2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件分析，樣品中芍藥苷平均含量為1.095 9 mg/g，RSD 為1.7%。

2.6.5 精密度試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)1 號(hào)樣品，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得供試品溶液中芍藥苷峰面積值的RSD 為0.4%。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)1 號(hào)樣品，分別在0、4、8、12、16 和24 h 按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件分析，各進(jìn)樣1 次，測(cè)得供試品溶液中芍藥苷峰面積值的RSD為0.5%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.7 加樣回收率試驗(yàn) 取本品(批號(hào)D200601)，研細(xì)，稱取0.5 g，精密稱定，共6 份，精密加入對(duì)照品溶液50 ml(0.011 6 mg/ml)，再按“2.6.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件分析，平均加樣回收率為102.05%，RSD 為1.5%。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)(n=6)

2.6.8 樣品測(cè)定 分別取3 批樣品，按“2.6.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇 通過對(duì)芍藥苷對(duì)照品溶液在200 ～400 nm 處進(jìn)行紫外光譜掃描檢測(cè)顯示，芍藥苷在230 nm 處有最大吸收，與文獻(xiàn)［2］采用的波長(zhǎng)相同。

3.2 提取方法的選擇

3.2.1 提取方式的確定 分別考查了超聲處理與加熱回流的方式，結(jié)果顯示兩種提取方法基本一致，故采用相對(duì)簡(jiǎn)便的超聲處理方式。

3.2.2 提取溶劑的選擇 分別采用甲醇、乙醇及稀乙醇為提取溶劑，結(jié)果顯示，以稀乙醇作為提取溶劑時(shí)，芍藥苷含量最高。

3.2.3 提取時(shí)間的選擇 分別考查了超聲處理30、45及60 min，結(jié)果顯示，提取45 min 與60 min 測(cè)定結(jié)果基本一致，故超聲處理時(shí)間選用45 min。

1 廖茂梁，張鐵軍，高文遠(yuǎn)，等.大孔吸附樹脂純化達(dá)原滴丸處方提取液的工藝研究. 中草藥，2008，39(1):54

2 中國(guó)藥典.一部.2005:635