逯 翀， 劉春萍， 趙向旺， 彭功玲

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，武漢 430022

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌細(xì)胞侵襲與遷移的特性是導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因。如何抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，阻斷癌細(xì)胞的侵襲與遷移，是目前乳腺癌治療研究的熱點(diǎn)之一。近年研究［1－3］表明，Notch信號通路是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要通路，Notch1可調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡，從而參與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展。但Notch1是否可以調(diào)控乳腺癌的侵襲、遷移能力，尚不是很清楚。我們應(yīng)用RT－qPCR 和Western blot技術(shù)以及Transwell小室侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)，檢測乳腺癌細(xì)胞系Notch1的表達(dá)及侵襲、遷移能力，初步探討Notch1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細(xì)胞系MCF－7及MCF－7／ADR（均由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)室提供），兔抗人Notch1單克隆抗體（購自美國Epitom－ics公司），DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)液、10%胎牛血清（FBS）（均購自美國Hyclone公司），青－鏈霉素溶液（購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），表皮生長因子（EGF，購自美國Peperotech公司），胰島素（Insulin，購自美國Sigma公司），鹽酸表柔比星（法瑪新，購自Pfizer），ECM 膠（購自美國Sigma公司），Transwell小室（購自美國Corning公司），結(jié)晶紫（購自武漢華順生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇細(xì)胞株，在含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)MCF－7及MCF－7／ADR 細(xì)胞株，用200ng／mL 的鹽酸表柔比星維持MCF－7／ADR 的耐藥性，細(xì)胞均呈貼壁生長，待細(xì)胞長滿瓶壁的80%，傳代。

1.2.2 RT－qPCR 檢測MCF－7及MCF－7／ADR 細(xì)胞株內(nèi)Notch1mRNA 的表達(dá) 分別取處于對數(shù)生長期的MCF－7 及MCF－7／ADR 細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA 然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)。Notch1及內(nèi)參GAPDH cDNA 片段擴(kuò)增的引物序列如表1；PCR 反應(yīng)擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min，94℃60s，55℃60s，共40個(gè)循環(huán)。各組設(shè)2個(gè)平行孔，電腦自動分析，導(dǎo)出相應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)，采用2－ΔΔCt方法，以GADPH 的表達(dá)為內(nèi)參，計(jì)算MCF－7 及MCF－7／ADR 細(xì)胞中Notch1 的相對表達(dá)量。

表1 Notch1及GADPH 基因的引物序列及片段長度（bp）Table 1 The primer sequence and amplification size of Notch1and GADPH

1.2.3 Western blot檢測MCF－7及MCF－7／ADR細(xì)胞株內(nèi)Notch1蛋白的表達(dá) 分別取處于對數(shù)生長期的MCF－7 及MCF－7／ADR 細(xì)胞，用裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，蛋白樣品濃度采用BCA 法測定，經(jīng)SDS－PAGE（12%分離膠）電泳，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過夜，加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，TBST 洗膜后加入ECL 發(fā)光液，顯色，曝光顯影及定影。βactin表達(dá)作為內(nèi)參照。

1.2.4 遷移實(shí)驗(yàn) 采用Transwell小室。取對數(shù)生長期的2株細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM／F12培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×105／mL。加200 μL細(xì)胞懸液至Transwell上室，下室加入30%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液600μL，每株細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。22h后0.1%結(jié)晶紫染色觀察穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量，作為評價(jià)遷移能力的指標(biāo)。高倍鏡下（×400）隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 侵襲實(shí)驗(yàn) 在Transwell小室上室鋪以ECM 膠（1mg／mL）放入24孔板，37℃靜置5h，吸出殘留液體。取對數(shù)生長期的2株細(xì)胞，胰酶消化后用DMEM／F12培養(yǎng)液懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×105／mL，加200μL 細(xì)胞懸液至上室，下室加入30%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液600μL，每株細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。22h后0.1%結(jié)晶紫染色后觀察穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量，作為評價(jià)侵襲能力的指標(biāo)。高倍鏡下（×400）隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 12.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)及Spearman秩相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細(xì)胞株Notch1mRNA的表達(dá)

細(xì)胞株MCF－7的Notch1 mRNA 表達(dá)水平為（0.046 1±0.002 2），MCF－7／ADR 的Notch1mRNA 表達(dá)水平為（0.074 8±0.004 3）；細(xì)胞株MCF－7／ADR 的Notch1基因表達(dá)水平明顯高于MCF－7，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 乳腺癌細(xì)胞株Notch1蛋白的表達(dá)

細(xì)胞株MCF－7的Notch1表達(dá)水平為（0.622 0±0.028 6），MCF－7／ADR 的Notch1 表達(dá)水平為（1.636 0±0.042 2）；細(xì)胞株MCF－7／ADR 的Notch1蛋白表達(dá)水平明顯高于MCF－7，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western blot檢測Notch1蛋白在乳腺癌細(xì)胞株MCF－7及MCF－7／ADR 中的表達(dá)Fig.1 The expression of Notch1protein in MCF－7and MCF－7／ADR cells detected by Western blot

2.3 MCF－7和MCF－7／ADR 細(xì)胞株侵襲能力的差異

細(xì)胞株MCF－7／ADR 的穿膜細(xì)胞數(shù)為（13.62±2.25），MCF－7的穿膜細(xì)胞數(shù)為（9.62±1.30）；細(xì)胞株MCF－7／ADR 的侵襲能力明顯高于MCF－7，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Transwell小室檢測乳腺癌細(xì)胞株MCF－7／ADR 及MCF－7侵襲能力（×400）Fig.2 The invasion ability of MCF－7and MAF－7／ADR cells detected by Transwell chambers（×400）

2.4 MCF－7和MCF－7／ADR 細(xì)胞株遷移能力的差異

細(xì)胞株MCF－7／ADR 的穿膜細(xì)胞數(shù)為（60.16±5.27），MCF－7的穿膜細(xì)胞數(shù)為（13.88±3.16）；細(xì)胞株MCF－7／ADR 的遷移能力明顯高于MCF－7，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Transwell小室檢測乳腺癌細(xì)胞株MCF－7／ADR 及MCF－7遷移能力（×400）Fig.3 The migration ability of MCF－7and MCF－7／ADR cells detected by Transwell chambers（×400）

2.5 Notch1與乳腺癌細(xì)胞株侵襲能力的相關(guān)性

Notch1mRNA 水平表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞侵襲能力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs＝0.85（P＜0.05）；Notch1蛋白表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞侵襲能力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs＝0.90（P＜0.05）。

2.6 Notch1與乳腺癌細(xì)胞株遷移能力的相關(guān)性

Notch1mRNA 表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞遷移能力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs＝0.92（P＜0.05）；Notch1蛋白表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞遷移能力呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs＝0.88（P＜0.05）。

3 討論

近年來，乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已躍居女性惡性腫瘤的首位。目前雖通過早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療等原則使乳腺癌患者的生存率有所提高，但結(jié)果仍不盡如人意，重要臟器的轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌患者死亡的最主要的原因［4－5］。乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力是導(dǎo)致乳腺癌轉(zhuǎn)移的重要因素，因此探討與乳腺癌侵襲和遷移相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物是目前乳腺癌研究的熱點(diǎn)［6－7］。

Notch信號通路可調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，是多種組織和器官早期發(fā)育所必需的細(xì)胞間調(diào)節(jié)信號，它通過鄰近細(xì)胞間相互作用精確調(diào)控各譜系細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化［8］。研究發(fā)現(xiàn)［9－10］Notch1在乳腺癌組織中表達(dá)高于周圍正常組織，和ER、HER－2等分子分型的表達(dá)關(guān)系密切，是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。近來有文獻(xiàn)報(bào)道［11－12］，Notch1信號通路的活化可以增加結(jié)腸癌、腎透明細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，但是Notch1 在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用并不確切。本研究以乳腺癌細(xì)胞株為研究對象，利用RT－qPCR 和Western blot技術(shù)檢測了乳腺癌細(xì)胞株MCF－7與MCF－7／ADR 中Notch1表達(dá)的差異，用Transwell小室檢測乳腺癌細(xì)胞株侵襲、遷移能力的差異。研究結(jié)果顯示，2株細(xì)胞中Notch1 的表達(dá)存在差異，MCF－7／ADR 細(xì)胞中Notch1 表達(dá)水平明顯高于 MCF－7 細(xì)胞，同時(shí)MCF－7／ADR 細(xì)胞的侵襲、遷移能力明顯高于MCF－7細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步探討Notch1與乳腺癌細(xì)胞侵襲、遷移的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Notch1的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力高度正相關(guān)。

Notch1信號通路參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力，阻斷該通路活化將可能抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移，從而開辟乳腺癌治療的新途徑。

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