李 偉， 邵樂南， 張小燕， 廖琳迪， 肖玉霞

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院口腔頜面外科，武漢 430030

口腔癌是一種與環(huán)境因素密切相關(guān)的疾病，煙草和酒精是已知的重要的致病因素。在口腔惡性腫瘤中，90%以上都是鱗狀細(xì)胞癌，占所有惡性腫瘤2%～3%［1］。舌鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma of the tongue，TSCC）是最常見的口腔鱗狀細(xì)胞癌，它生長快、浸潤性強，早期即可發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移率很高，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）能夠通過一系列的細(xì)胞表面受體將細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞核，從而發(fā)揮各種調(diào)節(jié)功能，包括細(xì)胞的分裂、增殖、生長、分化、運動和細(xì)胞死亡。MAPK 家族主要包括ERKs、p38－MAPK和JNK／SAPK，還有一些其它的MAPK 成員如ERK5和ERK7等［2］。大量研究發(fā)現(xiàn)Ras－Raf－MEKERK信號通路在許多人類惡性腫瘤中異常激活，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Ras是ERKs通路的上游蛋白，包括4個亞型Ha－Ras、N－Ras、Ki－Ras 4A 和Ki－Ras 4B，在人類大約20%的腫瘤中可以發(fā)現(xiàn)Ras的基因突變［3］。Raf是癌基因表達(dá)產(chǎn)物，包括A－Raf，B－Raf和Raf－1，其中B－Raf突變最為常見，在人類7%的癌變中可以檢測到B－Raf基因突變，特別是在惡性黑色素瘤，甲狀腺癌及結(jié)腸癌中尤為突出［4］。Ras及Raf功能突變都可以導(dǎo)致ERKs通路的異常激活，從而促使癌癥的發(fā)生。因此這條通路作為癌癥治療的靶點被廣泛研究。本實驗以人舌鱗癌細(xì)胞Cal－27為研究對象，通過應(yīng)用不同濃度的特異性ERK1／2信號通路抑制劑U0126進行干預(yù)后，觀察腫瘤細(xì)胞一系列生物學(xué)行為的變化，分析Ras－Raf－MEK－ERK 通路在舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移中的可能作用機制，探討MAPK 信號通路抑制劑在腫瘤治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

U0126（美國Cell Signaling 公司）；胎牛血清（HyClone公司）；胰蛋白酶（杭州四季青有限公司）；Annexin Ⅴ－FITC 試劑盒（上海貝博生物試劑公司）；二甲基亞砜（武漢科瑞科技有限公司）；MTT試劑盒（武漢鼎國生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人舌鱗癌細(xì)胞系Cal－27（同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室提供）常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)液中，含青霉素、鏈霉素（各1 U／mL），放置在37℃、5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長。0.25% 的胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，傳代培養(yǎng)用于后續(xù)試驗。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期Cal－27細(xì)胞，常規(guī)消化成2.5×104／mL的單細(xì)胞懸液，接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200μL（邊緣孔用無菌PBS填充）。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其融合到60%～70%后加藥。實驗分為空白調(diào)零組（即不加細(xì)胞懸液只含培養(yǎng)液）、陰性對照組（即加入細(xì)胞懸液和培養(yǎng)液）和實驗組（即加入細(xì)胞懸液、培養(yǎng)液和U0126），其中實驗組U0126藥物設(shè)4 個濃度梯度（5、10、20、40μmol／L），每組設(shè)3 個重復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)12、24、36、48h 后，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20μL MTT（5mg／mL），4h后棄上清，加入150μL DMSO 振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫測定儀檢測490nm 波長處的吸光度（A）值。以時間為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)使用統(tǒng)計軟件繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 細(xì)胞劃痕實驗

先用記號筆在6孔板背后，均勻地畫橫線，間隔大約0.5～1.0cm 一條，橫穿過孔。在每孔中加入5×105個細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至90%以上時，絲裂霉素預(yù)處理1h，抑制細(xì)胞分裂。用無菌槍頭垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能偏斜。無血清DMEM 洗細(xì)胞3 次，去除劃下的細(xì)胞，加入含不同濃度U0126（5、10、20、40μmol／L）的低血清培養(yǎng)液。放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、12、24、36、48h取樣拍照。

1.5 Transwell遷移試驗

0.25% 的胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，終止消化后離心棄培養(yǎng)液，用PBS 洗1～2 遍，無血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至2×105／mL。小室下層加入500μL 含2.5%FBS的培養(yǎng)液，上層加入200μL含不同濃度U0126（5、10、20、40μmol／L）細(xì)胞懸液，對照組不加U0126。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，棄去孔中培養(yǎng)液，甲醛室溫固定30min，0.5%結(jié)晶紫常溫染色10 min。清水漂洗干凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞。倒置顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞的數(shù)量，計算趨化指數(shù)（chemotactic index，CI）CI＝實驗組平均遷移細(xì)胞數(shù)／空白對照組平均遷移細(xì)胞數(shù)×100% 。

1.6 Transwell侵襲試驗

用50mg／L Matrigel 1∶8 稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50μL 含10g／L BSA 的無血清培養(yǎng)液，37℃、30 min。重復(fù)1.5的實驗步驟。以膜下的細(xì)胞多少來表示細(xì)胞的侵襲能力。計算侵襲指數(shù)（invasion index，II）II＝實驗組平均遷移細(xì)胞數(shù)／空白對照組平均遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

離心收集經(jīng)0、5、10、20、40μmol／L U0126 分別作用12、24、36、48h后的Cal－27細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞2次。400μL Annexin Ⅴ結(jié)合液懸浮細(xì)胞，細(xì)胞密度大約為1×106／mL。細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin Ⅴ－FITC 染色液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15min。加入10μL 碘化丙啶（PI）染色液輕輕混勻，于2～8℃避光條件下孵育5 min。1h內(nèi)上機檢測。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

收集經(jīng)0、5、10、20、40μmol／L U0126作用48 h后的Cal－27細(xì)胞，PBS洗2次，加入－4℃預(yù)冷的75%乙醇，4℃固定過夜，棄乙醇，PBS洗1次，加入Rnase 100μg／mL，加PI染色劑，避光染色20min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析及SNK－q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度U0126對Cal－27細(xì)胞生長的影響

結(jié)果表明5、10、20、40μmol／L U0126 均能抑制Cal－27細(xì)胞的增殖，并且隨著藥物劑量的增大，作用時間的延長，抑制效果呈上升趨勢，即在一定范圍內(nèi)呈時間－劑量依賴性。不同濃度組與陰性對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），各濃度組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 不同濃度U0126對Cal－27細(xì)胞運動能力的影響

光鏡下觀察，與對照組相比，U0126 對Cal－27細(xì)胞的運動有一定的抑制作用，濃度越高，抑制作用越強，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。結(jié)果如圖2。

2.3 不同濃度U0126對Cal－27細(xì)胞遷移能力的影響

經(jīng)過5、10、20、40μmol／L U0126處理后24h后，細(xì)胞遷移通過Transwell小室膜下的數(shù)量與對照組相比明顯減少，即細(xì)胞遷移能力隨藥物濃度升高呈下降趨勢。結(jié)果如圖3。

圖1 U0126對Cal－27細(xì)胞增殖生長曲線的影響Fig.1 Effect of U0126on growth curve of Cal－27cells

圖2 U0126對Cal－27細(xì)胞劃痕愈合的影響Fig.2 Effect of U0126on scratch healing of Cal－27cells

2.4 不同濃度U0126 對Cal－27細(xì)胞侵襲能力的影響

經(jīng)過5、10、20、40μmol／L U0126處理后24h后，細(xì)胞通過Matrigel膠遷移到Transwell小室膜下的數(shù)量與對照組相比明顯減少，即細(xì)胞侵襲能力隨藥物濃度升高呈下降趨勢。結(jié)果如圖4。

2.5 不同濃度U0126對Cal－27細(xì)胞凋亡的影響

U0126能促進Cal－27細(xì)胞凋亡，但在48h后各實驗組細(xì)胞才出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象，并且隨著U0126濃度的增加和作用時間的延長，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。不同濃度組與陰性對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），各濃度組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。如圖5，表1。

圖3 U0126作用24h對Cal－27遷移能力的影響Fig.3 Influence of U0126on migration ability of Cal－27cells

圖4 U0126作用24h對Cal－27侵襲能力的影響Fig.4 Influence of U0126on invasion ability of Cal－27cells

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測U0126作用48h對Cal－27細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Apoptosis of Cal－27cells treated with U0126for 48h

表1 U0126對Cal－27細(xì)胞凋亡的影響（%，±s，n＝3）Table 1 Effect of U0126on apoptosis of Cal－27cells（%，±s，n＝3）

表1 U0126對Cal－27細(xì)胞凋亡的影響（%，±s，n＝3）Table 1 Effect of U0126on apoptosis of Cal－27cells（%，±s，n＝3）

＊P＜0.05 vs.control group（0μmol／L U0126）

U0126（μmol／L）Normal wither cells Early wither cells Late wither cells Necrosis wither cells 0 86.88±1.32 7.35±0.45 3.36±0.36 2.41±0.43 5 83.59±1.23 9.18±1.51 5.25±0.45 2.65±0.42 10 73.59±1.38＊14.18±1.65＊ 9.61±0.98＊3.62±1.05 20 64.22±1.02＊18.81±1.56＊14.41±1.22＊3.56±0.52 40 54.36±1.55＊25.24±1.89＊16.85±2.11＊4.15±0.83

2.6 不同濃度U0126對Cal－27細(xì)胞周期的影響

與對照組相比，不同濃度U0126可以使腫瘤細(xì)胞周期各個時相細(xì)胞數(shù)所占比例發(fā)生變化。藥物作用后S期和G2／M 期腫瘤細(xì)胞比例減少，G0／G1期腫瘤細(xì)胞比例增加，且隨藥物濃度的增加而增多。如表2。

表2 U0126對Cal－27細(xì)胞增殖周期的影響（%，±s，n＝3）Table 2 Influence of U0126on cycle of Cal－27cells（%，±s，n＝3）

表2 U0126對Cal－27細(xì)胞增殖周期的影響（%，±s，n＝3）Table 2 Influence of U0126on cycle of Cal－27cells（%，±s，n＝3）

＊P＜0.05 vs.control group（0μmol／L U0126）

U0126（μmol／L）G0／G1S G2／M 0 52.23±0.74 36.15±1.43 10.55±0.79 5 56.41±0.76 33.35±1.46 10.12±0.83 10 62.26±0.84＊ 29.84±1.65＊9.48±1.23 20 75.54±1.23＊ 21.53±0.78＊4.15±0.98＊40 85.75±1.91＊ 12.29±0.77＊2.88±0.51＊

3 討論

細(xì)胞周期的紊亂，細(xì)胞的過度增殖以及凋亡減少是口腔癌形成的重要原因。細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)控制著細(xì)胞的生命活動，許多癌基因和抑癌基因位于細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的上游和下游，它們的功能異常與細(xì)胞的癌變也有著密切的聯(lián)系。

口腔癌是世界范圍內(nèi)第6大常見癌癥［5］。大多數(shù)低分化口腔癌死亡率很高，并且常伴有局部侵襲和區(qū)域性的轉(zhuǎn)移。因此探討其侵襲、轉(zhuǎn)移的機制具有重要意義。

MAPK 家族可以被多種細(xì)胞外信號激活，在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡中起著重要作用。MAPK 可以將細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞核，并通過轉(zhuǎn)錄因子控制基因的表達(dá)。哺乳類動物的MAPK 包括3個主要的亞型ERKs、JNK／SAPK 和p38－MAPK［6－7］。每一個MAPK 都有其特別的結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)著細(xì)胞重要的生理功能［8－10］。正常情況下，MAPK 嚴(yán)格地維持著細(xì)胞的生理平衡。在癌細(xì)胞中，這種平衡常常由于基因的不穩(wěn)定性而被打破，造成了細(xì)胞增殖和凋亡的改變，喪失其正常的生理功能。

ERK1／2信號通路是MAPK 家族中被研究得最廣泛的成員，可以被各種生長因子短暫而迅速地激活，包括EGF、NGF、PDGF。這些生長因子可以與特異的細(xì)胞表面受體比如G 蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶受體［11－12］相結(jié)合。ERK1／2信號通路涉及許多與人類癌癥發(fā)生相關(guān)的原癌基因以及各種因子。研究發(fā)現(xiàn)EGF－R 基因在惡性膠質(zhì)瘤、食管癌、肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)增強［13－15］。在口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中，30%以上都發(fā)現(xiàn)Ras原癌基因的過表達(dá)和突變。同時有研究表明在OSCC中，ERK1／2的基因mRNA 與腫瘤的TNM 分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［16］。出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移表明腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力較強，本實驗結(jié)果表明加入U0126后，腫瘤細(xì)胞穿過小室的數(shù)目減少，即遷移及侵襲能力減弱，并且與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)。說明舌鱗癌細(xì)胞的遷移和運動能力與ERK1／2通路有關(guān)，并且這一能力可以被U0126減弱，但不能被完全抑制。

Ras是小分子GTP連接蛋白，是許多信號通路的上游蛋白，這些通路包括Raf／MEK／ERK，PI3K／Akt和RalEGF／Ral［17］?，F(xiàn)已證明Ras有4 種亞型：Ha－Ras，N－Ras，Ki－Ras 4A 和Ki－Ras 4B。它們表現(xiàn)出高度的序列同源性以及相同的激活和失活模式?；罨訰as突變在30%人類癌癥中可以被檢出。Ras的過度活化可使下游通路持續(xù)激活，使細(xì)胞無限增殖，表現(xiàn)出惡性特征。本實驗用U0126暫時阻斷ERK1／2通路后，觀察到細(xì)胞增殖速度明顯減慢，而且我們還觀察到細(xì)胞形態(tài)從多角性逐漸趨于圓形，而且貼壁能力減弱，在較高藥物濃度持續(xù)作用下，大量細(xì)胞脫落，提示腫瘤細(xì)胞的增殖失控可能與ERK1／2通路的異常激活有關(guān)。

Raf絲／蘇氨酸家族包括3個亞型A－Raf，B－Raf和Raf－1。研究表明B－Raf比A－Raf和Raf－1顯示出更高的基礎(chǔ)激酶活性［18－19］，是下游激酶MEK 的主要激活劑，如果B－Raf缺失，則發(fā)現(xiàn)ERK 磷酸化水平降低［20］。提示來自B－Raf的異常信號可直接傳遞至MEK，進而激活整個ERK1／2通路，促使腫瘤發(fā)生。U0126為MEK 非ATP競爭性抑制劑，可在MEK 水平直接阻斷來自B－Raf的異常信號，由此可以推測U0126可能對治療由B－Raf突變引起的疾病有幫助。

目前化療仍然是治療許多惡性腫瘤的重要手段，很多化療藥物都是作用于腫瘤細(xì)胞分裂周期的各個階段，干擾其分裂，從而抑制細(xì)胞的增殖。本實驗結(jié)果表明U0126可使Cal－27細(xì)胞S 期和G2／M期腫瘤細(xì)胞比例減少，G0／G1期腫瘤細(xì)胞比例增加，從而抑制其有絲分裂。

細(xì)胞凋亡即細(xì)胞程序化死亡，是由遺傳物質(zhì)控制的細(xì)胞正常的生命活動，而抗凋亡則是腫瘤細(xì)胞的主要特征之一。本實驗結(jié)果表明用U0126 阻斷ERK 1／2通路可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提示ERK1／2通路參與了腫瘤的發(fā)生。

近年來信號通路被認(rèn)為是惡性腫瘤治療的潛在藥物靶點，大量小分子抑制劑被研發(fā)并用于臨床試驗，取得了良好的進展。索拉非尼是第一個也是唯一一個被認(rèn)可并應(yīng)用于臨床的Raf激酶抑制劑，它對其它激酶如VEGFR－2，VEGFR－3 和PDGFR－b也有靶向抑制作用［21］。U0126及PD98059兩者均為ERK1／2通路抑制劑，都為非ATP競爭性MEK抑制劑，體外研究發(fā)現(xiàn)，U0126和PD98059均可抑制人黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375的侵襲性，并同時發(fā)現(xiàn)MMP－9含量降低［22］。

本實驗結(jié)果也表明U0126 可以抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能夠抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示U0126可能對腫瘤治療有幫助。但是實驗結(jié)果也顯示U0126不能完全抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，說明可能有多條信號通路支配腫瘤細(xì)胞的生命活動，提示須將多條信號通路抑制劑聯(lián)合使用，才能達(dá)到治療的目的。應(yīng)該注意的是，信號通路也調(diào)節(jié)著正常細(xì)胞的生命活動，若被完全阻斷，勢必會對正常細(xì)胞造成不利影響，可能會引起毒性反應(yīng)，如何避免這一后果，還需要進一步研究。此外有動物實驗證明，MAPK 通路參與了由肺損傷引起的炎癥應(yīng)答反應(yīng)，應(yīng)用U0126進行干預(yù)，可以降低IL－2 和TNF－α的釋放，可以保護由脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷［23］。這也提示MAPK 抑制劑在治療炎性及其它疾病的應(yīng)用潛力。

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