吳 斌， 吳永超， 潘海濤， 郭曉東， 鄭啟新

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022

軸突脫髓鞘在脊髓損傷、多發(fā)性硬化和脊髓側(cè)索硬化等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理改變中都占有重要地位，脫髓鞘的軸突失去了正常的神經(jīng)傳導(dǎo)功能，導(dǎo)致機體出現(xiàn)感覺運動功能障礙，因此促進髓鞘再生是多種脊髓疾病的治療目標(biāo)。軸突脫髓鞘是因各種損傷因素導(dǎo)致少突膠質(zhì)細胞的凋亡、壞死引起的，當(dāng)軸突脫髓鞘后，脫髓鞘病變周圍的少突膠質(zhì)前體細胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）增殖并遷移至脫髓鞘區(qū)域，分化為少突膠質(zhì)細胞包裹軸突形成新的髓鞘，這一過程稱為髓鞘再生。有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的OPCs具有不同的生物學(xué)特性［1］，而且OPCs并不能遠距離地遷移，脊髓的脫髓鞘病變，只能由位于脊髓的OPCs完成髓鞘再生［2］。因此建立脊髓源性O(shè)PCs體外培養(yǎng)模型，并闡明其生物學(xué)特性對研究脊髓脫髓鞘疾病的發(fā)病機制及促進髓鞘再生具有重要意義。本研究采用免疫吸附法原代培養(yǎng)大鼠脊髓源性O(shè)PCs，并在體外觀察其增殖及分化等生物學(xué)特性，以期為使用各種干預(yù)手段促進OPCs更好地完成髓鞘再生奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

出生1～3d的Sprague－Dawley大鼠（同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供），雌雄不限，谷氨酰胺（Gib－co公司），DMEM／F12 培養(yǎng)液及胎牛血清（Hyclone公司），N2 添加劑及B27 添加劑（Invitrogen公司），血小板源性生長因子（platelet－derived growth factor，PDGF－aa）及堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（晶美公司），Hoechst33342（Hyclone公司），胰酶及多聚賴氨酸（Sigma 公司），髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗體及半乳糖腦苷脂（actocerebroside，GalC）抗體（Abcam 公司），RAN－2 抗體、NG2抗體及A2B5 抗體（Invitrogen 公司），熒光標(biāo)記二抗（武漢博士德公司）。

1.2 大鼠脊髓源性O(shè)PCs的分離培養(yǎng)

將新生大鼠斷頸處死后，75%乙醇浸泡消毒3 min，取出延髓以下脊髓組織，剝除腦脊膜及血管，將取出的脊髓切為1mm3的組織塊，浸入D－Hank液中，加入0.1%的胰蛋白酶，充分吹打混勻后置于37℃恒溫水浴中消化30min，之后加入等體積的含20%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液終止消化。將細胞懸液用70μm 的篩網(wǎng)過濾、離心及重懸后，接種至包被了RAN－2抗體的培養(yǎng)皿中以去除星形膠質(zhì)細胞及腦脊膜細胞，30 min 后收集未貼壁的細胞，接種至包被了A2B5抗體的培養(yǎng)皿中以獲得純化的OPCs，1h 后用0.25%的胰酶消化貼壁的細胞，漂洗、離心、重懸后接種至放有包被了多聚賴氨酸玻片的6孔板中，用無血清培養(yǎng)液（DMEM／F12含1%N2，1%B27，20 ng／mL bFGF，10 ng／mL PDGF－aa）進行培養(yǎng)，每2天更換1／3培養(yǎng)液。

1.3 大鼠脊髓源性O(shè)PCs的鑒定

免疫吸附純化的OPCs經(jīng)過24h的培養(yǎng)后，進行免疫熒光染色觀察其特異性標(biāo)志物A2B5 及NG2的表達情況，并計算其陽性率。具體方法如下：4%多聚甲醛固定細胞玻片，PBS 沖洗后，加入10%羊血清37℃孵育30min，加入A2B5（1∶200）及NG2（1∶200）抗體，4℃過夜；PBS漂洗后分別加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記的二抗（1∶500），37℃孵育30 min，PBS漂洗后加入Hoechst33342（1∶500）37℃避光孵育5min，甘油封片。空白對照用PBS代替一抗。隨機取5個視野，計算每個視野中NG2陽性細胞所占Hoechst33342染色細胞的百分比。

1.4 大鼠脊髓源性O(shè)PCs增殖能力的檢測

采用Alarm blue法檢測OPCs的增殖能力，繪制生長曲線。選擇生長良好的第2代的OPCs制成細胞懸液，將細胞密度調(diào)整為1×104／mL，以每孔200μL細胞懸液接種于96孔板，分7組，每組5個復(fù)孔。連續(xù)培養(yǎng)7d，每天取1組細胞，每孔加入20 μL Alarm blue原液，在細胞培養(yǎng)箱中孵育2h后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔A 值（吸收波長570nm）。

1.5 大鼠脊髓源性O(shè)PCs的誘導(dǎo)分化

將培養(yǎng)3d，生長良好的OPCs進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。撤去原來的普通培養(yǎng)液，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液（主要成分為DMEM／F12，1%NS，1%B27，30 ng／mL T3），在5%CO2，飽和濕度，37℃條件下培養(yǎng)，每3天更換新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)培養(yǎng)6d后行MBP及GalC免疫熒光染色，具體步驟同1.3項。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)的大鼠脊髓源性O(shè)PCs的生長情況

本研究采用免疫吸附法對大鼠脊髓組織中的OPCs進行純化，新生大鼠脊髓組織經(jīng)消化、過濾后獲得了混雜細胞懸液，鏡下觀察懸液中的大部分細胞呈球形、懸浮狀，將該細胞懸液依次經(jīng)過包被RAN－2抗體和A2B5抗體的培養(yǎng)皿分離純化，所得細胞胞體呈圓形，周圍折光明顯，部分細胞有雙極突起，接種24h后，可見大部分細胞貼壁，呈圓形或橢圓形，有雙極突起的細胞增多。

2.2 大鼠脊髓源性O(shè)PCs的鑒定

將原代培養(yǎng)24h的細胞經(jīng)固定后進行免疫熒光染色，觀察OPCs的特異性標(biāo)志物A2B5及NG2的表達情況，結(jié)果顯示：大部分細胞呈A2B5 及NG2陽性（圖1），鏡下隨機選取5 個視野，計算A2B5及NG2陽性細胞比例，發(fā)現(xiàn)兩者陽性的細胞比例均達95%以上。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下觀察大鼠脊髓源性O(shè)PCs的免疫熒光染色（×200）Fig.1 The immunofluorescence staining of OPCs derived from the spinal cord of rats under the confocal laser scanning microscopy（×200）

2.3 大鼠脊髓源性O(shè)PCs在體外的增殖能力

本研究采用Alarm blue法檢測OPCs的體外增殖能力，結(jié)果如圖2 所示。OPCs在體外環(huán)境的倍增時間約為4d，這說明本研究培養(yǎng)的大鼠脊髓源性O(shè)PCs在體外具有良好的增殖能力。

圖2 大鼠脊髓源性O(shè)PCs的細胞生長曲線Fig.2 The growth curve of OPCs derived from the spinal cord of rats

2.4 大鼠脊髓源性O(shè)PCs向成熟少突膠質(zhì)細胞的定向分化

加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液24h后，部分OPCs開始出現(xiàn)肉眼可見的形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)為胞體略增大，突起增多，隨著誘導(dǎo)時間的延長，發(fā)生形態(tài)變化的細胞逐漸增多，至誘導(dǎo)6d后大量細胞表現(xiàn)為成熟少突膠質(zhì)細胞樣形態(tài)，免疫熒光染色顯示，這些細胞呈MBP及GalC陽性（圖3），說明這些細胞為成熟的少突膠質(zhì)細胞。

圖3 激光共聚焦顯微鏡下觀察大鼠脊髓源性O(shè)PCs的分化潛能（×200）Fig.3 The multiple differentiation potential of OPCs derived from the spinal cord of rats under the confocal laser scanning microscopy（×200）

3 討論

少突膠質(zhì)前體細胞來自于胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管腹側(cè)神經(jīng)上皮細胞，隨著神經(jīng)管的發(fā)育，OPCs逐步增殖、遷移并分化為成熟少突膠質(zhì)細胞，形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的髓鞘［3］。OPCs作為一種成體干細胞廣泛分布于成年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，當(dāng)缺血、缺氧、創(chuàng)傷、感染及自身免疫反應(yīng)等各種損傷因素使少突膠質(zhì)細胞凋亡、壞死從而導(dǎo)致脫髓鞘病變時，OPCs開始增殖并遷移至脫髓鞘區(qū)域，分化為少突膠質(zhì)細胞包裹脫髓鞘軸突形成新的髓鞘。目前認為，OPCs并非一種均質(zhì)、單一的細胞類型，而且源自中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的OPCs具有不同的生物學(xué)特性，例如來自海馬的OPCs表達成熟星形膠質(zhì)細胞標(biāo)志物S100，而來自大腦皮層的OPCs 并不表達S100［4］。還有研究表明發(fā)生脫髓鞘病變后，只能招募脫髓鞘病變周圍2mm 范圍內(nèi)的OPCs進行髓鞘再生［5］，因此脊髓的脫髓鞘病變，只能由位于脊髓的OPCs完成髓鞘再生。綜上所述，建立OPCs體外培養(yǎng)模型，并闡明其生物學(xué)特性對促進脊髓脫髓鞘疾病的髓鞘再生具有重要意義。

原代培養(yǎng)OPCs首先需要對OPCs進行分離純化，目前常用的分離純化方法有兩類：一類是利用不同細胞粘附性的差異純化OPCs，如差速振蕩法［6］；另一類是利用不同細胞表面標(biāo)志物的差異，通過免疫吸附純化OPCs，包括免疫磁珠法［7］、流式細胞儀分選法［8］以及培養(yǎng)皿免疫吸附法［9］。差速振蕩法操作簡便，但獲得的OPCs純度較低；免疫磁珠法和流式細胞儀分選法所獲得的OPCs純度較高，但其成本較高，而且操作復(fù)雜，應(yīng)用不是很廣泛；培養(yǎng)皿免疫吸附法操作相對簡單，而且可以獲得較高純度的OPCs，因此本研究采用培養(yǎng)皿免疫吸附法從新生大鼠脊髓組織中分離純化OPCs。脊髓組織中存在多種類型的細胞，其中對OPCs原代培養(yǎng)影響最大的是星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和腦脊膜細胞。RAN－2是星形膠質(zhì)細胞、室管膜細胞和腦脊膜細胞的特異性表面標(biāo)志物，因此本研究首先利用包被了RAN－2抗體的培養(yǎng)皿去除星形膠質(zhì)細胞及腦脊膜細胞，還有些研究者主張再用成熟少突膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)志物GalC 包被的培養(yǎng)皿去除少突膠質(zhì)細胞［10］，然而我們在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)這一步驟會使OPCs大量損失，因此本研究沒有采用這一步驟，而是直接用包被了A2B5 抗體的培養(yǎng)皿富集純化OPCs。后續(xù)的免疫熒光染色鑒定結(jié)果顯示本研究獲得的OPCs純度在95%以上，這表明本研究采用的免疫吸附法是純化OPCs簡便、高效的方法。

在體外條件下維持OPCs的增殖能力，需要采用無血清培養(yǎng)液并添加生長因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)bFGF、PDGF－aa、IGF、NGF 等生長因子能夠促進OPCs增殖。本研究在培養(yǎng)液中添加了bFGF 和PDGF－aa，同時使用了B27和N2營養(yǎng)成分，結(jié)果顯示該培養(yǎng)液能夠使OPCs保持未分化狀態(tài)，并且增殖良好。本研究采用Alarm blue法檢測了原代培養(yǎng)的脊髓源性O(shè)PCs的增殖能力，實驗結(jié)果顯示脊髓源性O(shè)PCs在體外培養(yǎng)條件下能夠繼續(xù)增殖，其倍增時間約為4d。OPCs作為一種成體干細胞，具有多向分化潛能，在特定條件下可分化為少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元。本研究對脊髓源性O(shè)PCs進行了誘導(dǎo)分化實驗，結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后，部分OPCs就開始出現(xiàn)肉眼可見的形態(tài)學(xué)變化，隨著誘導(dǎo)時間的延長，發(fā)生形態(tài)變化的細胞逐漸增多，誘導(dǎo)6d后大部分細胞呈MBP 及GalC 陽性，這說明脊髓源性O(shè)PCs在體外培養(yǎng)條件下仍然具備良好的分化為少突膠質(zhì)細胞的潛能。

綜上所述，本研究采用免疫吸附法成功建立了大鼠脊髓源性O(shè)PCs的體外培養(yǎng)模型，并通過體外實驗觀察其增殖及分化等生物學(xué)特性，實驗結(jié)果表明本研究培養(yǎng)的脊髓源性O(shè)PCs在體外條件下具有良好的增殖能力及分化為成熟少突膠質(zhì)細胞的能力，為進一步研究脊髓源性O(shè)PCs如何參與脊髓脫髓鞘疾病的病理過程奠定了基礎(chǔ)。

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