熊永潔， 尹 波， 甘 莉， 王 倩， 張?zhí)K明

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430030

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（cerebral microvascular endothelial cells，CMECs）是血腦屏障的重要組成部分，在血管神經(jīng)單元（neurovascular unit，NVU）的各成分中，是實(shí)現(xiàn)血腦屏障功能的執(zhí)行者，并參與了功能的調(diào)節(jié)［1］。在對(duì)血腦屏障功能的研究中，尤其是在對(duì)血管神經(jīng)單元的其他成分與CMECs相互作用從而發(fā)揮對(duì)血腦屏障功能調(diào)節(jié)作用［2］的研究中，CMECs是必不可少的研究材料。目前用于研究的微血管內(nèi)皮細(xì)胞主要分為細(xì)胞系和原代培養(yǎng)兩種，但對(duì)于CMECs的研究而言，來源于原代培養(yǎng)者更接近體內(nèi)性質(zhì)，因而更具有研究?jī)r(jià)值。然而，其在培養(yǎng)方法上一直存在操作復(fù)雜、易受雜細(xì)胞污染等許多問題［3］，高純度、高產(chǎn)量地從小型動(dòng)物中分離培養(yǎng)獲得CMECs仍面臨許多困難。

本實(shí)驗(yàn)采用兩次酶消化法及梯度離心法從C57乳小鼠腦皮質(zhì)分離獲得CMECs，得到了較高純度和產(chǎn)量的CMECs，為CMECs原代培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)及進(jìn)一步研究CMECs的功能作用等提供了參考與方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

每次實(shí)驗(yàn)使用8～10只1～3d的C57乳小鼠，由本實(shí)驗(yàn)室所飼養(yǎng)的C57小鼠合籠后獲得。C57小鼠購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，在SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)。

1.2 試劑

DMEM 培養(yǎng)液（Hyclone公司）、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司）、膠原酶／分散酶（Roche 公司）、牛血清白蛋白（BSA，Sigma 公司）、DNA 酶Ⅰ（DNaseⅠ，Sigma公司）、胎牛血清（FBS，Hyclone公司）、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子添加物（ECGS，Sciencell公司）、3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT，Amersco公司）、兔抗人Ⅷ因子抗體（Santa公司）、兔抗小鼠GFAP抗體（Santa公司）、FITC－羊抗兔IgG（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、4%多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）、4，6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI，Clabiochem 公司）、青－鏈霉素（北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.3 CMECs的原代培養(yǎng)

將C57乳小鼠置于75%乙醇消毒5min，取出小鼠，置于盛有冷PBS的培養(yǎng)皿中，用眼科鑷和眼科剪無菌操作取出全腦，置于另一盛有冷PBS的培養(yǎng)皿中，去除嗅球、小腦、間腦（包括海馬）后，將大腦反置于無菌濾紙上，去除腦白質(zhì)，然后將剩余灰質(zhì)在濾紙上輕輕滾動(dòng)，仔細(xì)去除軟腦膜及大血管。將經(jīng)上述處理過的組織移至裝有DMEM 培養(yǎng)液的EP管中，剪成1mm3大小，吹勻，轉(zhuǎn)至15mL 離心管，離心（1 000r／min，5min）后棄上清。加入0.1%Ⅱ型膠原酶（用DMEM 培養(yǎng)液配置，內(nèi)加30 U／mL的DNaseⅠ），37℃振蕩消化1.5h，離心（1 000r／min，8min）后棄上清。加入20%BSA（PBS 配置）懸浮混勻，4℃離心（4 000r／min，20min），棄上層漂浮的組織及液體。底部沉淀加入0.1%膠原酶／分散酶37℃振蕩消化30 min，離心（1 000r／min，5 min）棄上清，底部在紅細(xì)胞層上方的黃白色沉淀即為純化的微血管段。用PBS漂洗2遍后（1 000r／min，5min）用CMECs完全培養(yǎng)液重懸（DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液、20%FBS、100 U／mL 青－鏈霉素、1%ECGS），接種于培養(yǎng)瓶，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。24h后換液，以后2～3d換1次液，完全融合后即可按一般方法傳代。

1.4 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞

于接種后每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁、形態(tài)及生長狀況，并拍照記錄。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

取傳至3代的CMECs接種于24孔板，細(xì)胞密度調(diào)整至103／mL，每孔培養(yǎng)液定量至500μL，每隔24h選3 孔細(xì)胞加入50μL MTT（5 mg／mL），置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4h后終止培養(yǎng)。取出小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入375μL DMSO，振蕩10 min 后取200μL 液體至96 孔板，測(cè)490nm 處吸光度值。7d后將獲得的全部數(shù)據(jù)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線圖。

1.6 特異性免疫熒光化學(xué)鑒定

取傳至3代的CMECs接種于6孔板中，貼壁24h后取出，0.1%PBS小心清洗后用4%多聚甲醛固定10 min，0.1%PBS沖洗5 min×3，1%Triton 100破膜10min，0.1%PBS沖洗5min×3，山羊血清封閉20min，加入兔抗人Ⅷ因子抗體或兔抗小鼠GFAP抗體（1∶50），4℃濕盒孵育過夜，0.1%PBS沖洗3遍后加入FITC－羊抗兔IgG（1∶200），室溫避光孵育1h，0.1%PBS沖洗5min×3，DAPI（1∶1 000）染核明確活細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察。

1.7 透射電鏡觀察細(xì)胞

取傳至3代的CMECs接種于載玻片上，培養(yǎng)形成單層細(xì)胞后吸去培養(yǎng)液，PBS 小心清洗后用4%多聚甲醛固定1h，然后PBS漂洗，再用1%四氧化鋨固定15～30 min，系列乙醇逐級(jí)脫水后EPON812包埋劑包埋，經(jīng)超薄切片機(jī)切片并鈾染色后在透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下細(xì)胞形態(tài)

原代接種培養(yǎng)24h后，光鏡下可觀察到零散分布的少量貼壁細(xì)胞，細(xì)胞呈多角形或短梭形，并島嶼樣聚集。此外還可見一些漂浮的細(xì)胞碎片及雜細(xì)胞，隨后的換液及傳代培養(yǎng)可去除細(xì)胞碎片及雜細(xì)胞（圖1A）。培養(yǎng)3～5d后，可見之前島嶼樣聚集的細(xì)胞集落增大，集落內(nèi)細(xì)胞排列呈“漩渦狀”，并有相互融合的趨勢(shì)（圖1B）。培養(yǎng)6～8d后，各細(xì)胞集落之間也開始融合，并形成單層，原集落中心的細(xì)胞相互緊密連接，形成“鋪路石”樣排列（圖1C）。

2.2 細(xì)胞生長曲線

取對(duì)數(shù)生長期的CMECs，采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖，并繪制生長曲線。生長曲線如圖2，曲線呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞應(yīng)有的“S”形，其形態(tài)符合CMECs的生長規(guī)律。

2.3 細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)鑒定

使用免疫熒光組織化學(xué)法檢測(cè)所獲得細(xì)胞上CMECs特異性的Ⅷ因子相關(guān)抗原及GFAP相關(guān)抗原，Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測(cè)呈陽性（圖3），GFAP相關(guān)抗原檢測(cè)呈陰性（結(jié)果未展示），表明所獲得細(xì)胞上具有CMECs的Ⅷ因子特異性標(biāo)記物。取3次獨(dú)立的原代培養(yǎng)所獲得的系列細(xì)胞進(jìn)行上述熒光檢驗(yàn)，每次檢驗(yàn)取10個(gè)獨(dú)立視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，最后計(jì)算獲得所培養(yǎng)的CMECsⅧ因子相關(guān)抗原陽性率達(dá)95.5%，而GFAP陽性率則低于1%。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)Fig.1 The cell morphology under the inverted phase contrast microscopy

圖2 MTT 法測(cè)定腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長曲線Fig.2 Growth curve of cerebral microvascular endothelial cells determined by MTT assay

圖3 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光染色Fig.3 Immunofluorescence of cerebral microvascular endothelial cells by anti－factorⅧ

2.4 電鏡下細(xì)胞形態(tài)

取融合成單層的CMECs進(jìn)行電鏡觀察，可觀察到相鄰細(xì)胞間存在緊密連接（圖4）。

圖4 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的透射電鏡圖Fig.4 TEM diagram of the cerebral microvascular endothelial cells

3 討論

目前，微血管內(nèi)皮細(xì)胞以其有別于其他內(nèi)皮細(xì)胞的性質(zhì)正成為研究熱點(diǎn)，而獲得細(xì)胞的方法則主要分為細(xì)胞系和原代培養(yǎng)兩種。細(xì)胞系是通過對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)一些永生化的基因而獲得的，在使用中具有操作簡(jiǎn)單、增殖快的優(yōu)點(diǎn)，但是與體內(nèi)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，由于其分化程度較低，故而缺少屏障特性［4］，此外由于導(dǎo)入了外源基因，也表現(xiàn)出復(fù)雜的核型改變［5］，從而限制了其在研究中的使用范圍。而與外周微血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，CMECs更具有以下特殊的性質(zhì)：①更緊密的細(xì)胞間連接，是周圍毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間連接緊密程度的50～100倍，形成這一特殊性質(zhì)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)主要是CMECs間的緊密連接（tight junction，TJ），其對(duì)旁細(xì)胞通路嚴(yán)格限制，從而阻止了親水性物質(zhì)的滲透［6］。②帶有負(fù)電荷的內(nèi)皮表面，阻止了負(fù)電荷物質(zhì)通過血腦屏障。③低胞飲作用。CMECs具有統(tǒng)一的胞質(zhì)厚度，胞質(zhì)內(nèi)少見囊泡，且無內(nèi)皮窗孔，基膜連續(xù)，從而大大減少了跨細(xì)胞運(yùn)輸［7］。④含有更多的線粒體，為血腦屏障通透性的高度選擇性提供了能量保障［8］。這些特殊性質(zhì)正是血腦屏障維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)，因而使用細(xì)胞系培養(yǎng)方法所獲得的微血管內(nèi)皮細(xì)胞并不能完全代表CMECs的真實(shí)性質(zhì)，用其來研究血腦屏障的功能顯然是不全面的，故而原代培養(yǎng)的CMECs是必不可少的研究材料［9］。

本實(shí)驗(yàn)通過探索各種不同的分離和培養(yǎng)方法［3，10－12］，最終獲得了一種步驟較為簡(jiǎn)易，且費(fèi)用較為經(jīng)濟(jì)的CMECs原代培養(yǎng)方法。與以往的原代培養(yǎng)多使用SD 大鼠的方法不同，本實(shí)驗(yàn)中使用了C57小鼠。SD 大鼠屬于遠(yuǎn)交群，其個(gè)體之間在遺傳基因方面差異性較大，而C57 小鼠屬于近交系，具有更均一的遺傳基因，因而所獲得的CMECs均一性更好，利于減少應(yīng)用其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的混雜因素。小鼠與大鼠相比，由于大腦較小會(huì)帶來操作困難，混雜細(xì)胞增多等問題，這也是以往培養(yǎng)多采用大鼠的原因，然而近交系大鼠價(jià)格較高，會(huì)帶來實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)增多的問題。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在所有原代操作步驟中最需要注意的步驟為腦膜的剝離，腦膜剝離越徹底，最后獲得細(xì)胞純度越高，但也需注意控制整個(gè)操作的時(shí)間，因操作時(shí)間越久，組織活性越低。經(jīng)過多次實(shí)踐練習(xí)的熟練操作者一般在2h內(nèi)可完成組織分離及腦膜剝離的操作，最終獲得較高純度的CMECs并具有很高的重復(fù)性。在實(shí)驗(yàn)方法上，使用20%牛血清白蛋白替代Percoll試劑來分離微血管段［13］，不僅便于試劑的準(zhǔn)備，也更為經(jīng)濟(jì)。我們實(shí)驗(yàn)室所獲得的CMECs平均陽性率達(dá)95.5%，不低于甚至高于以往文獻(xiàn)報(bào)道的陽性率［10－12］。

CMECs主要應(yīng)用于雙細(xì)胞、乃至三細(xì)胞共培養(yǎng)體系構(gòu)建血腦屏障的研究中，隨著對(duì)血腦屏障認(rèn)識(shí)的加深，尤其是血管神經(jīng)單元概念的強(qiáng)化，對(duì)于所使用的CMECs細(xì)胞材料的要求也越高，因而需要不斷尋求更接近體內(nèi)性質(zhì)CMECs的獲得方法。此外，目前許多研究也發(fā)現(xiàn)，CMECs參與了許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的進(jìn)程，如：阿爾茨海默病、帕金森病等，而并非以往認(rèn)識(shí)的是這些疾病損傷的后期事件；而對(duì)體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞微環(huán)境的研究也證實(shí)CMECs是其重要組成部分，CMECs具有維持神經(jīng)干細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)其分化方向的性質(zhì)。這些新的認(rèn)識(shí)拓展了CMECs的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用范圍，也給CMECs原代培養(yǎng)方法的進(jìn)一步改進(jìn)提供了新的契機(jī)和挑戰(zhàn)。

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