林小英 沈育華 沈永棟 游根勇 郭書林 黃印堯

（1.廈門市牧興實業(yè)有限公司 361100；2.廈門出入境檢驗檢疫局 361026）

為了保證豬場生產(chǎn)的安全，一個種豬場，每年都必須開展疫病抗體檢測，及時掌握豬群的健康水平，就可以有效防止疫病的發(fā)生和流行。當(dāng)前我國開展抗體檢測的常用方法有乳膠凝集法、間接血凝法、酶聯(lián)免疫吸附法、金標(biāo)法等。金標(biāo)法是近年來研發(fā)的一種新的檢測方法，目前我們已研制出檢測豬瘟抗體、豬偽狂犬病抗體、豬藍(lán)耳病抗體、豬圓環(huán)病毒（PCV-2）病抗體和口蹄疫（O型）抗體的金標(biāo)檢測試紙。

1 金標(biāo)檢測試紙

1.1 金標(biāo)法的原理 膠體金是一種負(fù)電荷的疏水膠體，同時膠體金顆粒對蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的吸附功能，可與毒素、酶、糖蛋白、抗生素和激素等多種物質(zhì)非共價結(jié)合，成為免疫反應(yīng)的優(yōu)良標(biāo)記物。應(yīng)用層析技術(shù)和吸水紙的引力，標(biāo)志的抗原（抗體）與對應(yīng)的抗體（抗原）可以直接在硝酸纖維膜上進(jìn)行反應(yīng)，形成肉眼可見的紫紅色抗原抗體復(fù)合物。

1.2 免疫金標(biāo)試紙的制作方法 采用膠體金免疫層析技術(shù)，以豬瘟抗體金標(biāo)試紙為例，將豬瘟抗原包被在硝酸纖維薄膜上的檢測線上，將兔抗豬瘟抗原抗體包被在硝酸纖維薄膜的對照線上，豬瘟抗原經(jīng)膠體金標(biāo)記后噴在玻璃纖維膜上，干燥后附著在硝酸纖維薄膜的下端，在硝酸纖維薄膜的上端粘貼著吸水紙，見圖1。當(dāng)血清或血液樣品滴加于加樣處，如果加入血液，試劑中的紅細(xì)胞過濾系統(tǒng)會自動的將紅細(xì)胞攔下而讓血清通過。由于層析原理，血清開始向吸水紙上部移動，當(dāng)液體遇到干燥的膠體金豬瘟抗原時將其溶解，并繼續(xù)往上移動至硝酸纖維膜的檢測區(qū)。如果樣品中有豬瘟抗體存在，包被在檢測線上豬瘟抗原和金標(biāo)豬瘟抗原與樣品中的豬瘟抗體將會在檢測線上形成一個雙夾心的免疫復(fù)合物，并在檢測線上形成一條紅色或紫紅色線。如果樣品中沒有豬瘟抗體，金膠體豬瘟杭原將不會與包被在檢測線上的豬瘟抗原形成復(fù)合物，檢測線上沒有色帶出現(xiàn)。樣品的血清和膠體金豬瘟抗原繼續(xù)往上移動至對照線上的兔抗豬瘟抗原抗體將會與膠體金標(biāo)志的豬瘟抗原結(jié)合，在對照線上形成一條紅色或紫紅色，說明本試劑有效。

圖1 金標(biāo)試紙示意圖

圖2 結(jié)果判定示意圖

1.3 操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn) 按照已發(fā)布的福建省地方標(biāo)準(zhǔn)（豬瘟抗體金標(biāo)試紙檢測方法DB35/916-2009）操作。

1.3.1 操作方法 撕開鋁箔袋，將檢測卡平放于桌面上，在檢測卡圓形加樣孔（S）內(nèi)加入100 uL待檢樣品（血液或血清），室溫下靜置15 min判定結(jié)果。

1.3.2 判定標(biāo)準(zhǔn) 見圖2。無效：在對照線（C）和檢測線（T）都不出現(xiàn)紫色線；陰性：在對照線（C）出現(xiàn)一條色線，在檢測線（T）不出現(xiàn)色線，說明待檢測樣品是陰性，或抗體滴度達(dá)不到抵御野毒攻擊的最低保護(hù)水平；陽性：對照線（C）和檢測線（T）都出現(xiàn)一條紫紅色線，則為陽性。檢測線顏色越深，說明抗體滴度越高。檢測線（T）出現(xiàn)一條顏色很淺的紫色線，則樣品呈弱陽性，說明抗體滴度已達(dá)到抵御野毒攻擊的最低保護(hù)水平。

1.4 金標(biāo)法與其他檢測法的比較 從表1可以看出，金標(biāo)試紙與其他試劑一樣，具有微量、特異、準(zhǔn)確的優(yōu)點，試劑單份包裝、常溫保持、保質(zhì)期長（一年以上），檢測時不需要特定的任何儀器設(shè)備，待檢樣品可以是血清、溶血血清或血液；檢測方法簡便、檢測流程僅需15 min，結(jié)果直觀容易判定，可以單份樣品檢測，檢測成本低廉，每份樣品只需3～5元。雖然，在檢測結(jié)判定上，金標(biāo)試紙不能像ELISA那樣用OD值數(shù)字表示，但金標(biāo)法可以通過檢測線顏色的深淺表達(dá)抗體水平的高低。鑒于金標(biāo)試紙有其獨特的優(yōu)點，它特別適用于基層獸醫(yī)站和養(yǎng)豬場使用。

表1 金標(biāo)法與其他檢測法的比較

2 免疫金標(biāo)試紙在豬場疫病防控上的應(yīng)用

牧興實業(yè)有限公司有一個4000頭母豬和年出欄3萬頭大豬的豬場，每年都對種公豬、后備母豬和生產(chǎn)母豬進(jìn)行1～2次的豬五大疫?。ㄘi瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病、口蹄疫和圓環(huán)病毒?。┟庖呖贵w檢測，以前應(yīng)用進(jìn)口試劑，要成批采集血清，溶血的樣品不能檢測，檢測的時間長，更主要是成本很高。近年來，采用金標(biāo)試紙檢測，采集的血液、血清、溶血的血清樣品都可以用。操作簡便、而且檢測的成本很低，在實際使用中，總結(jié)出以下幾點經(jīng)驗。

2.1 選擇適合本場使用的疫苗（即檢驗購買的疫苗的質(zhì)量） 豬場新購進(jìn)的批量疫苗，使用前應(yīng)進(jìn)行疫苗的質(zhì)量檢查、選擇適合本場使用的疫苗。以豬瘟疫苗為例，具體做法是選擇健康生豬，豬瘟抗體水平是陰性，先取一瓶豬瘟疫苗，根據(jù)說明書要求的劑量注射疫苗。等待產(chǎn)生抗體達(dá)到最高的時候（活疫苗注射后28 d；滅活疫苗注射后35 d），抽取血液或經(jīng)離心的血清，應(yīng)用豬瘟抗體金標(biāo)試紙進(jìn)行抗體檢測，如果抗體水平達(dá)標(biāo)，該批疫苗可以使用；如果抗體水平不達(dá)標(biāo)，該批疫苗不能使用，要查找原因，是疫苗本身質(zhì)量或其他原因，需再試驗，或另換其他廠家疫苗。

2.2 開展豬場抗體水平普查 為了保證豬群生產(chǎn)的安全，對一個種豬場，每年都必須開展疫病抗體的檢測，及時掌握豬群的健康水平，就可以有效防止疫病的發(fā)生和流行。具體做法是根椐豬場歷年發(fā)生疫病的情況，每年必須開展2次抗體普查，重點以種豬為主，抽檢比例為：種公豬100%，后備母豬配種前100%，生產(chǎn)母豬5%～10%，不同日齡（保育舍小豬、中豬）菜豬抽檢0.5%～1%，檢測的項目一般以豬的五大疫?。ㄘi瘟、偽狂犬病、藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病、口蹄疫）為主。根椐檢測結(jié)果，分析各種抗體水平的達(dá)標(biāo)率和離散度，并對豬場的健康水平進(jìn)行綜合評價。根椐我們近年來檢測結(jié)果統(tǒng)計，如果同一種抗體水平參差不齊，離散度大，就有可能近期發(fā)病，如果離散度小，豬群較安全。如果豬瘟抗體水平達(dá)標(biāo)，一般藍(lán)耳病、偽狂犬病和圓環(huán)病毒病的抗體也基本能達(dá)標(biāo)；豬瘟抗體不達(dá)標(biāo)，則藍(lán)耳病、偽狂犬病、圓環(huán)病毒病抗體中都有不達(dá)標(biāo)出現(xiàn)，因此，如果豬場的豬瘟抗體能保持較高水平，一般說豬場是比較安全的。

2.3 制定正確的免疫程序 目前國家有出臺指導(dǎo)性的生豬免疫程序，但各豬場有不同的疫病情況，應(yīng)根椐抗體水平的消長規(guī)律進(jìn)行調(diào)整。目前報道較多的是豬瘟、口蹄疫，可以用金標(biāo)試紙進(jìn)行檢測，先測定母源抗體水平，決定首免時間，根據(jù)首免后的抗體水平?jīng)Q定二免時間。這樣制定的免疫程序更適合本場使用。

2.4 豬場豬瘟凈化

2.4.1 操作方法 首先是種豬要先凈化，種豬每年接種豬瘟疫苗2～3次，要求所有公豬、經(jīng)產(chǎn)母豬的豬瘟抗體水平達(dá)到合格以上（即在試紙的檢測線顏色要深）。后備母豬一般僅接種過豬瘟疫苗2～3次，其抗體水平要比種豬和經(jīng)產(chǎn)母豬低，但都必需達(dá)到合格水平。對抗體水平不合格的種豬要加大劑量進(jìn)行豬瘟疫苗免疫，間隔1個月后再抽血測定豬瘟抗體，如果達(dá)標(biāo)的算合格；如未能達(dá)標(biāo)還應(yīng)再次加大劑量免疫，間隔1個月再測定，如果豬瘟水平不達(dá)標(biāo)則視為豬瘟帶毒豬、或嚴(yán)重感染了免疫抑制病毒，應(yīng)淘汰。為保持本場種豬群豬瘟的凈化，每年均應(yīng)開展2次豬瘟抗體檢測。

2.4.2 凈化結(jié)果判定 種公豬和經(jīng)產(chǎn)母豬每年經(jīng)過2～3次的豬瘟疫苗接種，要求所有公豬、經(jīng)產(chǎn)母豬的豬瘟抗體水平達(dá)到合格以上（即在試紙的檢測線顏色要深）。后備母豬一般僅接種過豬瘟疫苗2～3次，其抗體水平會比種豬和經(jīng)產(chǎn)母豬低，但都必需達(dá)到合格水平。

對抗體水平不合格的種豬要加大劑量再次進(jìn)行豬瘟疫苗免疫，間隔1個月后再抽血測定豬瘟抗體，如果達(dá)標(biāo)的算合格；如未能達(dá)標(biāo)還應(yīng)再次加大劑量免疫，間隔1個月再測定，如果豬瘟水平不達(dá)標(biāo)則視為豬瘟帶毒豬、或嚴(yán)重感染免疫抑制病毒，應(yīng)淘汰。

為保持本場種豬群豬瘟的凈化，每年均應(yīng)開展2次豬瘟抗體檢測。

2.5 為疫病診斷提供依據(jù) 當(dāng)前發(fā)生的豬病大都是多病原混合感染，癥狀不典型，給診斷造成很大困難，診斷時可以采取以下方法。

1）根據(jù)患豬的臨床表現(xiàn)和病理變化推測出可能是**病。

2）根椐豬只免疫情況，推測豬在正常情況下應(yīng)該保持的抗體水平，如豬注射**疫苗后的1～3個月間應(yīng)該有保護(hù)性抗體，如果沒有保護(hù)性抗體，就有可能是疫苗質(zhì)量、免疫程序或免疫抑制病毒的干擾等原因；如豬不注射**疫苗，就不可能產(chǎn)生**抗體，如有產(chǎn)生就可能是野毒感染的緣故，而且抗體水平較高。

3）抽取數(shù)頭患豬血液就地進(jìn)行抗體水平檢測（一般要檢測豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬病、圓環(huán)病毒病抗體），根椐三方面結(jié)果，就可以得出基本正確的診斷意見。比如，臨床有藍(lán)耳病的肺部病變，豬曾經(jīng)注射過豬瘟疫苗2次、藍(lán)耳病疫苗2次、偽狂犬病疫苗2次和圓環(huán)病毒病疫苗1次，原來都應(yīng)產(chǎn)生抗體，抽血檢測發(fā)現(xiàn)，僅豬瘟有弱陽性抗體，其余都沒有抗體存在，綜合判斷應(yīng)該是藍(lán)耳病。

3 小結(jié)

經(jīng)過多年測試，膠體金免疫金標(biāo)試紙具有微量、準(zhǔn)確、快速、操作簡便、結(jié)果直觀、容易判定、成本低的優(yōu)點，非常適合養(yǎng)豬場、基層獸醫(yī)站使用。金標(biāo)試紙可作為豬場新購進(jìn)疫苗的質(zhì)量檢測、豬群抗體水平的普查、豬場免疫程序的制定、豬場疫病診斷和豬瘟凈化的檢測試劑。

致 謝 本文承蒙福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院李國平教授審閱，特此致謝！