陳俊玉 方成俊 何建順

（1.東山出入境檢驗檢疫局 福建東山 363401；2.中國檢驗認(rèn)證集團(tuán)廈門有限公司漳州分公司 福建漳州 363000）

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是結(jié)合了抗原抗體的特異性反映和酶的高效催化顯色反映而形成的一種檢測方法，具有特異性好、靈敏度高、操作簡便易學(xué)、所需設(shè)備較少等優(yōu)點，適合于批量樣品的篩選檢測，目前廣泛用于藥物殘留快速初篩檢測。本文結(jié)合ELISA法在動物源性食品中氯霉素殘留量檢測中的應(yīng)用，參照國際計量局（BIPM）關(guān)于試驗不確定度評定方法的建議書和JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》規(guī)范，就檢測結(jié)果不確定度情況進(jìn)行分析評定。

1 ELISA檢測中不確定度來源

檢測中不確定度的來源：（1）取樣帶來的不確定度。（2）被測樣品由于提取或分離不完全帶來的不確定度。（3）在測量過程中環(huán)境條件的影響帶來的不確定度。（4）稱量和容量儀器的不確定度。（5）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所給定的不確定度以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在使用過程中產(chǎn)生的變化而引起的不確定度。（6）在測量方法和過程中的某些近似和假設(shè)。（7）檢測人員讀數(shù)不準(zhǔn)或操作中的隨機(jī)誤差帶來的不確定度。

2 材料和方法

2.1 試劑和設(shè)備 氯霉素酶聯(lián)免疫測定試劑盒、酶標(biāo)儀、電子天平、瓶口移液器、單通道微量移液器。

2.2 檢測過程（按照SN/T1604-2005）

3 ELISA法檢測動物源性食品中氯霉素殘留量中的不確定度評定

3.1 稱樣的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（稱樣）rel稱取樣品3.0 g，為計算方便，設(shè)實際稱重為3.00 g。稱量天平稱量不確定度主要為稱量變動性，根據(jù)電子天平技術(shù)參數(shù)，其變動性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01 g，按照均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01/31/2＝0.0058，則稱樣的相對不確定度為：U c（稱樣）rel＝0.0058/3.00＝0.00193。

3.2 樣品稀釋液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（樣品）rel 3.2.1 乙酸乙酯純度的不確定度Uc（乙酸乙酯）rel乙酸乙酯純度為（99.5±0.5）%，按均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差，即相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（乙酸乙酯）rel＝0.005/31/2＝0.00289。

3.2.2 移取乙酸乙酯的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（提取液）rel用瓶口移液器取1次6 mL乙酸乙酯，根據(jù)瓶口移液器的檢定結(jié)果為0.003 mL，按照平均分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差，即相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（提取液）rel＝0.003/31/2＝0.00173。

3.2.3 稀釋樣品帶來的不確定度Uc（稀釋）rel用單通道微量移液器取1.0 mL稀釋緩沖液，根據(jù)單通道微量移液器的技術(shù)指標(biāo)和檢定結(jié)果，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 0.0024，即 Uc（稀釋）rel＝0.00240。

將以上三個項目合成，則Uc（樣品）rel＝（0.002892＋0.001732＋0.002402）1/2＝0.00414。

3.3 ELISA試驗操作過程的不確定度Uc（試驗）rel

3.3.1 微量移液器加樣Uc（加樣）rel用單通道微量移液器加樣50 uL（整個試驗每孔均只加樣1次）所帶來的相對不確定度為Uc（加樣）rel＝0.00240。

3.3.2 反應(yīng)溫度帶來的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（溫度）rel使用低溫生化培養(yǎng)箱來獲得ELISA的底物溫度25℃，根據(jù)低溫生化培養(yǎng)箱技術(shù)指標(biāo)，溫度波動范圍為±1.0℃，按照均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0/31/2＝0.58 ℃，則 Uc（溫度）rel＝0.58/25＝0.0232。

3.3.3 反應(yīng)時間的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（時間）rel在ELISA試驗過程中，反應(yīng)時間也可能產(chǎn)生不確定度。根據(jù)日常試驗經(jīng)驗，取反應(yīng)時間變動范圍為±30 s。根據(jù)均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為30/31/2＝17.3 s，則Uc（時間）rel＝［（17.3/（60×60））2+（17.3/（30×60））2］1/2＝0.0108。

將上述三項相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成，得到Uc（試驗）rel＝（0.002402＋0.02322＋0.01082）1/2＝0.0257。

3.4 酶標(biāo)儀讀數(shù)相對不確定度Uc（酶標(biāo)儀）rel從Labsystems-MK3酶標(biāo)儀在1～1.5吸光度單位內(nèi)的不確定度為 0.5%，則 Uc（酶標(biāo)儀）rel＝0.005。

3.5 數(shù)據(jù)處理帶來的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uc（計算）rel因在檢測結(jié)果數(shù)據(jù)處理中，需根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品的檢測結(jié)果進(jìn)行計算，在這過程中，所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線是被假設(shè)成真實的標(biāo)準(zhǔn)曲線，也就帶來了數(shù)據(jù)處理方面的不確定度，可用標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)來反映，根據(jù)檢測經(jīng)驗數(shù)據(jù)，r＝0.990，則 Uc（計算）rel＝0.010。

3.6 合成不確定度Uc（合成）rel將3.1-3.5各項分相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行合成，則得到ELISA法檢測動物源性食品中氯霉素含量的合成不確定度：

3.7 展伸不確定度（總不確定度） 取包含因子K＝3（置信水平＝0.997），則：

總不確定度 UC＝K×Uc（合成）rel＝3×2.84%＝8.52%。

4 結(jié)論

從上述不確定度分析可以看出，按照SN/T1604-2005用ELISA法對動物源性食品中氯霉素含量進(jìn)行檢測，在置信水平P為0.997時，其相對不確定度為8.52%，與其他分析方法的相對不確定度比較而言較大，主要與ELISA法本身特性有關(guān)：（1）ELISA法結(jié)合了抗原抗體的免疫反映和酶的高效催化反應(yīng)，檢測限較低，特異性好，方便使用于檢測痕量物質(zhì)，而痕量物質(zhì)的檢測必然伴隨較大不確定度。（2）ELISA法檢測需使用多種生化、免疫學(xué)及分子生物學(xué)試劑，如抗原、抗體、底物TMB等，這些試劑本身所具有的不穩(wěn)定性對檢測結(jié)果也相應(yīng)帶來較大的直接影響。（3）用ELISA法檢測時還受到反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、洗滌效果、人員操作等其他因素的影響，這也是不確定度的重要來源。

［1］ 國家技術(shù)質(zhì)量監(jiān)督局.JJF1059-1999測量不確定度評定與表示［S］.北京：中國計量出版社，1999.

［2］ 曹志軍，盧利軍.測試實驗室中測量不確定度評定［M］.長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2003.

［3］ 趙春城，趙曉.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法的試驗不確定度分析［J］.飼料研究，2004（11）：31-33.

［4］ 黃超群，劉海山，謝文.蜂蜜中氯霉素殘留量測定的不確定度評估［J］.化學(xué)分析計量，2010（3）：7-10.

［5］ 孫久龍，張悅，牛燕，等.出口肉及肉制品中氯霉素殘量檢驗方法不確定度評估［J］.分析實驗室，2009（12）：331-334.

［6］ 嚴(yán)鳳，張文剛，李丹妮，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中氯霉素殘留量不確定度分析［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008（5）：32-33.

［7］ 康繼韜，俞雪鈞，李佐卿，等.氣相色譜測定氯霉素殘留量不確定度的評定［J］.現(xiàn)代測量與實驗室管理，2003（3）：17-19.