孔鋮將, 黃左安, 陳 炯, 史雨紅, 陸新江

（寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室, 浙江 寧波 315211）

香魚補體成分C9基因的克隆、序列分析及表達

孔鋮將, 黃左安, 陳 炯*, 史雨紅, 陸新江

（寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室,浙江 寧波315211）

補體成分C9是構(gòu)成膜攻擊復(fù)合體引起靶細(xì)胞溶解破壞的重要組成成分。該文測定了香魚C9(aC9)基因的cDNA全序列, 序列全長2 125個核苷酸, 編碼一個由592個氨基酸組成、相對分子質(zhì)量為6.56×104的前體蛋白, N端22個氨基酸為信號肽序列。序列分析表明, aC9與虹鱒C9的氨基酸同源性最高, 達56.8%, 與其它魚類C9的同源性介于40.9%～53.8%之間。aC9在健康香魚肝、脾、腸、鰓和肌肉有表達, 其中在肝內(nèi)的表達量最高。實時熒光定量PCR的結(jié)果顯示, 鰻利斯頓氏菌侵染4 h后, 肝中aC9mRNA表達量顯著上調(diào), 并隨著時間的推移在16 h時達到峰值。Western blotting分析的結(jié)果顯示, 鰻利斯頓氏菌侵染后香魚血清中的aC9蛋白隨著時間的推移呈顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明, 香魚肝組織C9基因表達變化與鰻利斯頓氏菌的侵染密切相關(guān), 揭示了C9在魚類抗細(xì)菌免疫反應(yīng)中具有重要的作用。

補體成分C9; 香魚; 鰻利斯頓氏菌; 實時熒光定量PCR; Western blotting

補體系統(tǒng)參與機體防御與炎癥反應(yīng), 通過溶解病原體或募集吞噬細(xì)胞的方式, 清除大部分病原體。補體系統(tǒng)通過多種途徑調(diào)控免疫功能, 如炎癥細(xì)胞的趨化作用、增強巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用、肥大細(xì)胞脫粒、調(diào)節(jié)B、T細(xì)胞的免疫應(yīng)答和增強抗原免疫原性等(Dunkelberger & Song, 2010; Toapanta & Ross, 2006)。補體系統(tǒng)除了作為先天免疫與獲得性免疫的補充之外, 還調(diào)節(jié)組織再生(Rutkowski et al, 2010)、腫瘤生長(Qu et al, 2009)以及某些病理狀況, 如非典型性溶血尿毒癥和老年性黃斑退化癥等(Wagner & Frank, 2010)。與哺乳動物類似, 魚類的補體激活主要包括三條途徑：經(jīng)典途徑(Classical pathway)、旁路途徑(Alternative pathway)和凝集素途徑(Lectin pathway)(Endo et al, 2011; Sarmar & Ward, 2011)。補體激活的后期成分C5b～C9形成膜攻擊復(fù)合物(Membrane attack complex, MAC), 可通過破壞病原體細(xì)胞膜的完整性致使細(xì)胞溶解(Muller-Eberhard, 1986; Fosbrink et al, 2005)。哺乳動物的補體成分C9是一類單鏈糖蛋白, 糖鏈含量占總相對分子質(zhì)量的7.8 % (Biesecker et al, 1982), 參與靶細(xì)胞表面MAC的形成, 是補體系統(tǒng)激活并攻擊破壞靶細(xì)胞的重要補體固有成分。近年來, 多種魚的C9研究已被報道, 如河豚(Fugu rubripes)(Yeo et al, 1997)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)(Katagiri et al, 1999)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Stanley & Herz, 1987; Tomlinson et al, 1993; Chondrou et al, 2006)、草魚(Ctenopharyngodon idella)(Li et al, 2007)和斑馬魚(Danio rerio)(Encinas et al, 2010)等。

香魚(Plecoglossus altivelis)屬胡瓜魚目香魚科,是東亞地區(qū)一種小型經(jīng)濟名貴魚類, 在中國沿海各地均有分布。由于高密度養(yǎng)殖, 種質(zhì)退化等原因?qū)е虏『Πl(fā)生頻繁, 其中以鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum)最為嚴(yán)重(Li et al, 2009)。由于香魚對養(yǎng)殖環(huán)境要求較高, 且綠色養(yǎng)殖已經(jīng)成為一種趨勢,傳統(tǒng)的抗生素等藥物防治已經(jīng)越來越不適應(yīng)最新的養(yǎng)殖要求, 因此, 迫切需要深入研究香魚免疫相關(guān)基因, 來指導(dǎo)香魚病害防治(Uenobe et al, 2007; Chen et al, 2008)。本研究通過文庫測序結(jié)合RACE的方法成功獲得了香魚C9(aC9)基因的cDNA全序列, 并分析了其序列特征及mRNA的組織表達特征,同時通過原核表達制備了小鼠抗aC9血清, 并以此研究了鰻利斯頓氏菌侵染后香魚血清中aC9的表達變化, 為進一步深入研究C9在魚類抗細(xì)菌免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

實驗材料：健康香魚50尾, 個體重20～25 g, 購自寧波水產(chǎn)大世界; ICR小鼠購自寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心; 鰻利斯頓氏菌香魚分離株ayu-H080701、大腸桿菌TG1、BL21 pLys E和原核表達載體pET-28a由本實驗室保存。

試劑：Gel Extraction Kit購自O(shè)mega公司; 辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司; 肽N-糖苷酶F (PNGase F)購自New England Biolabs公司; RNAiso、Oligotex-dT30＜super＞mRNA Purification Kit、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、Ex TaqDNA聚合酶、100 bp DNA Ladder Marker、DNA Ligation Kit Ver.2.0、cDNA Library Construction Kit和SYBRPremix Ex Taq等試劑盒購自Takara公司; ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、顯影定影試劑盒、柯達X-OMAT BT膠片和壓片暗盒購自碧云天生物技術(shù)研究所; 引物合成及序列測定由上海英駿生物工程公司完成; 其他常規(guī)化學(xué)藥劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 樣品制備

選取4尾健康香魚, 采集肝、脾、腎、腦、心、鰓、肌肉、腸等組織, 液氮保存, 用于aC9基因mRNA的組織表達特征分析。剩余的香魚分為實驗組和對照組, 各23尾, 實驗組每尾香魚腹腔注射100 μL鰻利斯頓氏菌懸液(1.0×105CFU/mL PBS),對照組每尾香魚注射100 μL無菌PBS。注射后24 h,隨機挑選實驗組香魚3尾進行病原菌分離, 確認(rèn)接種效果(Li et al, 2009)。實驗組和對照組香魚分別于腹腔注射后4、8、16、24 和36 h取樣, 每次3尾/組, 其中尾靜脈抽取的血液于4 ℃靜置4 h, 析出血清離心后-70 ℃保存, 其余樣品，如肝組織等于液氮保存。

1.3 香魚aC9基因cDNA全序列獲得及序列分析

采用文庫測序的方法獲得aC9基因cDNA的部分序列(Huang et al, 2011), 結(jié)合RACE方法擴增獲得aC9基因cDNA 5'-和3'-末端序列, 序列拼接后得到aC9基因cDNA全序列。信號肽序列預(yù)測采用SignalP 3.0在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/), 結(jié)構(gòu)特征分析采用Scanprosite (http:// www.expasy.org/tools/scanprosite/)和Motifscan在線程序 (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan),多重序列比對、進化分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建采用MEGA 4.0 (Tamura et al, 2007)。

1.4 香魚aC9基因mRNA的組織表達特征分析

組織表達特征分析相關(guān)的RNA提取、DNase I處理和第一鏈cDNA合成等方法詳見文獻(Huang et al, 2011)。根據(jù)aC9基因cDNA序列跨內(nèi)含子設(shè)計一對擴增引物C9ex10F (5'-CCTGAATTCGAAGGA CTGGC-3')和C9ex11R (5'-CAGAGAGTTGGCCTG TCTTG-3'), 預(yù)期擴增片段長160 bp。內(nèi)標(biāo)采用看家基因β-actin, 擴增引物為pActin2(+)/pActin2(-), 預(yù)期擴增片段長234 bp (Huang et al, 2011)。PCR擴增以合成的各組織cDNA為模板, 25 μL的反應(yīng)體系如下：cDNA 模板25 ng, 10×ExPCR 緩沖液2.5 μL, dNTP混合物(各2.5 mmol/L) 2 μL, 正向和反向引物(10 μmol/L)各1 μL,Ex TaqDNA聚合酶1.25 U,雙蒸水補足25 μL。94 ℃變性2 min后, 按以下程序進行28個循環(huán)：94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 循環(huán)結(jié)束后72 ℃繼續(xù)延伸反應(yīng)7 min。PCR產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳分離, 溴化乙錠染色檢測。

1.5 與鰻利斯頓氏菌侵染相關(guān)的香魚肝組織aC9基因mRNA的表達變化

取腹腔注射后不同時間的香魚肝組織, 檢測aC9基因mRNA表達量的變化。每一取樣時間點的實驗組和對照組魚各3尾, 分別抽提肝組織總RNA。RNA抽提、DNase I處理和第一鏈cDNA合成等方法同文獻(Huang et al, 2011)。實時熒光定量PCR (RT-qPCR)采用25 μL反應(yīng)體系, 含SYBRPremix Ex Taq(2×)緩沖液12.5 μL, 正向和反向引物(10 μmol/L)各1 μL, 模板0.5 μL, 滅菌水10 μL。擴增反應(yīng)在Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀上進行, 94 ℃變性180 s后, 按以下程序進行40個循環(huán)：94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s。為確保特異性擴增, PCR結(jié)束后對擴增產(chǎn)物進行熔解曲線分析,流程為94 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 95 ℃ 30 s。每一個樣品技術(shù)重復(fù)3次。熒光定量結(jié)果由程序MxPro 3.2讀取, 采用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-??Ct(Livak & Schmittgen, 2001)分析相對定量結(jié)果。

1.6 香魚aC9的原核表達和抗血清制備

設(shè)計原核表達引物pET-28a-C9(+)(5'-CCATATGAGGACCTTCTCTACTGT-3') 和pET-28a-C9(-)(5'-GGGATCCTTAACAGTAATCGTCGCTGC-3'), 以香魚肝組織cDNA為模板, PCR擴增aC9基因全長開放閱讀框架, 預(yù)期大小產(chǎn)物(1 790 bp)經(jīng)1 % (w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離后, 切膠純化。純化產(chǎn)物經(jīng)NdeI和BamH I雙酶切, 插入pET-28a載體, 獲得重組質(zhì)粒pET-28a-aC9。轉(zhuǎn)化有pET-28a-aC9的大腸桿菌BL21 pLys E經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后, SDS-PAGE檢測。預(yù)期大小的誘導(dǎo)表達蛋白條帶切膠純化后免疫小鼠, 制備抗血清 (Huang et al, 2011)。

1.7 血清蛋白的去糖基化

根據(jù)糖苷酶試劑盒說明, 取目標(biāo)蛋白9 μL(約20 μg), 加入10×糖蛋白變性緩沖液1 μL, 100 ℃變性10 min, 冷卻到室溫后, 加入1 μL的10×G7緩沖液, 1 μL的10% NP-40, 1 μL的PNGase F (500 U/μL), 37 ℃反應(yīng)1 h。加入上樣緩沖液處理樣品后, Western blotting鑒定目標(biāo)蛋白電泳遷移情況。

1.8 蛋白質(zhì)印跡

蛋白樣經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后, 轉(zhuǎn)NC膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(Huang et al, 2011)。一抗為前所制備的小鼠抗aC9抗血清, 二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, 采用SPSS軟件(13.0)中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統(tǒng)計,P＜0.05為顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 香魚aC9基因cDNA序列分析

aC9基因cDNA序列全長2 125個核苷酸(GenBank登錄號：FR714486), 編碼一個由592個氨基酸組成、相對分子質(zhì)量為6.56×104的前體蛋白。前體蛋白N端22個氨基酸為信號肽序列, 成熟肽aC9預(yù)測相對分子質(zhì)量為6.34×104。結(jié)構(gòu)域分析顯示, 該蛋白具有已知的C9特征性的結(jié)構(gòu)(Li et al, 2007; Katagiri et al, 1999; Tomlinson et al, 1993; Yeo et al, 1997), 包括TSP1 (thrombospondin type-1)結(jié)構(gòu)域(Asp41～ Asn94)、LDLa (low-density lipoprotein receptor class A)結(jié)構(gòu)域(Leu100～Asp135)、MACPF (MAC/perforin)結(jié)構(gòu)域(Val138～Lys503) 和EGF-like (epidermal growth factor like)結(jié)構(gòu)域(Cys522～Cys533)。多重序列比對發(fā)現(xiàn), 魚類和哺乳類C9在蛋白的C端有較大差異, 魚類C9在此區(qū)域還具有另一個TSP1結(jié)構(gòu)域(Lys549～Pro586), 但哺乳動物中沒有(圖1)。糖基化位點預(yù)測揭示, aC9序列存在1個潛在的N-糖基化位點(Asn254)。

氨基酸序列比較表明, aC9與虹鱒C9同一性最高, 達56.8%, 與其它魚類C9的同一性介于40.9%～53.8%之間, 與哺乳動物C9的同一性低于32.8%。系統(tǒng)進化樹分析揭示, 魚類C9和哺乳動物C9分別成簇, 在魚類C9中, 斑馬魚和草魚C9緊密成簇, 區(qū)別于其他魚類C9, aC9與虹鱒C9的進化關(guān)系最近(圖2)。

2.2 香魚aC9基因mRNA組織表達特征

圖1 一些魚類和哺乳動物C9的C末端區(qū)序列的比對Fig.1 Multiple alignment of the C-terminal amino acid sequences of fish and mammalian C9

圖2 基于NJ法構(gòu)建的動物C9蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the amino acid sequences of animals C9 using neighbor-joining method

基因組DNA經(jīng)DNase I處理后, PCR擴增aC9和β-actin, 沒有發(fā)現(xiàn)明顯的條帶, 說明處理后的基因組DNA并不對RT-PCR結(jié)果產(chǎn)生干擾(圖3)。各組織樣品cDNA的PCR擴增結(jié)果表明, 健康香魚aC9基因mRNA主要在肝組織中表達, 在脾和腸組織中也有一定量表達, 鰓和肌肉中有微量表達,而其他組織未擴增到可見條帶(圖3)。

2.3 鰻利斯頓氏菌侵染后肝組織aC9基因mRNA的表達變化

圖3 香魚aC9基因mRNA的組織表達特征Fig.3 The mRNA expression pattern of ayu aC9

圖4 鰻利斯頓氏菌侵染后香魚肝組織aC9基因mRNA的表達變化Fig.4 Dynamic expression of ayu aC9 mRNA in ayu liver during Listonella anguillarum infection

在所檢測的各組織中,aC9基因的mRNA主要在肝中表達, 我們隨后用RT-qPCR方法進一步研究與細(xì)菌感染相關(guān)的肝組織aC9基因mRNA表達量的變化。結(jié)果表明, 細(xì)菌感染4 h,aC9基因mRNA表達量顯著上調(diào), 達到對照組的2.65倍, 16 h時表達量達到峰值, 為對照組的31.97倍, 此后表達量下降, 但直到36 h, 仍顯著高于對照組(19.79倍)（圖4）。

2.4 香魚aC9的原核表達及血清中成熟肽的糖基化驗證

重組菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達、超聲波裂解后, 在SDS-PAGE分離膠中觀察到一條相對分子質(zhì)量約為6.8×104的誘導(dǎo)表達蛋白條帶(圖5a), 與計算的aC9融合蛋白相對分子質(zhì)量吻合(6.78×104)。該蛋白條帶切膠純化后免疫小鼠, 制備抗血清。

據(jù)軟件預(yù)測, aC9序列中存在一個潛在的N-糖基化位點Asn254。Western blotting結(jié)果表明, 血清中的aC9成熟肽相對分子質(zhì)量約為6.76×104, 比計算值大4.2×103左右, 而經(jīng)PNGase F處理后, 相對分子質(zhì)量轉(zhuǎn)變?yōu)?.35×104, 與計算值基本吻合。揭示aC9存在翻譯后N-糖基化修飾(圖5b)。糖鏈含量，占總分子量的6.07%。

2.5 鰻利斯頓氏菌侵染后香魚血清aC9的含量變化

用前所制備的香魚aC9多抗, Western blotting分析鰻利斯頓氏菌侵染0、4、8、16、24和36 h時的香魚血清蛋白樣品(圖6)。結(jié)果表明, 細(xì)菌侵染后,香魚血清中的aC9含量持續(xù)增加, 4 h時增加到正常表達量的3.0倍, 至36 h時, 達到正常表達量的5.8倍。

圖5 香魚aC9基因的原核表達和血清中成熟肽的糖基化驗證Fig.5 Prokaryotic expression of ayu aC9 and the confirmation of its posttranslational N-glycosylation

圖6 Western blotting檢測鰻利斯頓氏菌侵染后香魚血清aC9含量變化Fig.6 Western blotting analysis of ayu serum aC9 content during Listonella anguillarum infection

3 討 論

本文采用文庫隨機測序結(jié)合RACE的方法, 獲得了香魚補體成分aC9的全長cDNA序列。序列分析表明, 香魚aC9具有已知的C9特征性結(jié)構(gòu), 并且魚類C9的C端比哺乳動物C9多一個TSP1結(jié)構(gòu)域(Tomlinson et al, 1993; Li et al, 2007), 但動物C9序列的差異是否引起功能上的差異, 尚有待進一步研究。香魚aC9存在翻譯后的N-糖基化修飾, 這與已報道的哺乳動物C9結(jié)果一致(Bunkenborg et al, 2004)。系統(tǒng)進化樹分析表明, 魚類C9和哺乳類C9分別成簇, 香魚aC9與虹鱒C9最相似。

組織表達特征研究揭示, 健康香魚aC9基因mRNA主要在肝中表達, 脾中有一定量表達, 腸、肌肉和鰓中也有少量表達, 其他組織中未檢測到。已知魚類C9基因mRNA的組織表達特征有一定差異, 如草魚在血液、肌肉、表皮、腸、胸腺、鰓、脾、腎、肝、腦、心和頭腎等12個組織中均有表達(Li et al, 2007), 而虹鱒則在腦、腸、腎、肝和脾組織中表達(Chondrou et al, 2006)。

香魚由于其經(jīng)濟價值, 近年來在中國的養(yǎng)殖面積日益增加, 但病害問題嚴(yán)重, 其中鰻利斯頓氏菌是養(yǎng)殖香魚弧菌病的主要病原之一。因此, 有必要對鰻利斯頓氏菌侵染后香魚的免疫反應(yīng)進行研究。補體是魚類免疫防御系統(tǒng)的重要組成成分, C9參與形成靶細(xì)胞表面攻膜復(fù)合物(MAC), 導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解。本文研究表明, 鰻利斯頓氏菌侵染后, 肝組織中aC9基因mRNA顯著增加, 16 h時達到峰值, 到36 h仍顯著高于對照組, 揭示肝組織大量合成aC9。近期研究表明, 草魚注射接種柱狀黃桿菌(F. columnare) 1 d后, 肝組織C9基因mRNA表達量顯著上調(diào)(Li et al, 2007); 患病毒性出血性敗血癥的斑馬魚鰭中C9基因mRNA表達量上調(diào)15.33倍(Encinas et al, 2010), 與我們的結(jié)果吻合。香魚aC9基因mRNA的表達模式與大部分肝內(nèi)表達的急性期反應(yīng)蛋白(acute phase protein, APP)相似(Witzel-Schlomp et al, 2001; Shi et al, 2010; Huang et al, 2011)。免疫印跡研究表明, 細(xì)菌侵染后短期內(nèi),香魚血清aC9的含量即顯著增加, 揭示它是一種APP。動物APPs的種類繁多, 結(jié)構(gòu)和功能多種多樣, 它們相互協(xié)調(diào)以去除炎癥刺激物、弱化局部炎癥和促進組織修復(fù)和再生, 從而使機體回復(fù)到內(nèi)穩(wěn)態(tài)(Gerwick et al, 2002)。

綜上所述, 本文報道了香魚補體成分aC9基因的cDNA全序列, 并對其在肝中的表達量變化與鰻利斯頓氏菌侵染過程進行了相關(guān)研究, 為魚類抗細(xì)菌免疫的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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Molecular cloning, sequence analysis and expression of ayu complement componentC9gene

KONG Cheng-Jiang, HUANG Zuo-An, CHEN Jiong*, SHI Yu-Hong, LU Xin-Jiang

(Key laboratory of Applied marine Biotechnology, Ministry of Education, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

C9, a component of the membrane attack complex, participates in the final stage of the complement cascade which lyses foreign organisms by disrupting the integrity of their cell membranes. In the present study, a full-length ayu C9 (aC9) cDNA was cloned which contains 2,125 nucleotides and encodes a protein of 592 amino acids. A signal peptide was deposited in the N-terminal 22 residues. The deduced amino acid sequence of aC9 showed 56.8% identity to the C9 of rainbow trout, and 40.9% to 53.8% identity to the C9 of other teleosts. RT-PCR analysis demonstrated that the mRNA ofaC9was expressed in the liver, spleen, intestine, gill and muscle of healthy ayu fish with the highest level in the liver. Quantitative RT-PCR analysis showed thataC9transcripts were significantly up-regulated in the liver at 4 h postListonella anguillaruminfection, peaked at 16 h post injection. Western blotting analysis revealed that serum aC9 significantly increased inListonella anguillaruminfected ayu fish. Our results suggested that aC9 may play an important role in fish immune response of anti-bacteria.

Complement component C9; Ayu;Listonella anguillarum; RT-qPCR; Western blotting

Q785; Q959.499; Q516

A

0254-5853-(2012)02-0151-07

10.3724/SP.J.1141.2012.02151

2011-11-21；接受日期：2011-12-26

教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-08-0928);寧波市自然科學(xué)基金項目(2010A610001)

?通信作者(Corresponding author)，Tel: 0574-87609571, E-mail: jchen1975@163.com

孔鋮將(1986—),男,浙江紹興人,碩士研究生,研究方向：分子生物學(xué); Tel: 13586883124; E-mail: kongchengjiang@163.com