馬楊，盧士玲，李開雄，李寶坤

(石河子大學食品學院，新疆石河子，832000)

新疆特色酸凝奶酪是新疆哈薩克地區(qū)少數(shù)民族最喜愛的乳制品之一，它是依靠乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸達到酪蛋白的等電點，從而使酪蛋白凝固而制成。奶酪中的風味化合物包括原料乳中的風味化合物以及成熟過程中產(chǎn)生的化合物，可以分為揮發(fā)性的風味物質(zhì)和非揮發(fā)性的風味物質(zhì)。非揮發(fā)性風味物質(zhì)即水溶性風味物質(zhì)，主要包括蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物如氨基酸和肽、游離脂肪酸、有機酸如乳酸等，這些風味物質(zhì)對奶酪滋味的強烈程度有很大影響。

外國學者對奶酪非揮發(fā)性風味物質(zhì)做了大量且深入的研究。Lawlor［1］等人對8種硬質(zhì)奶酪的揮發(fā)性、非揮發(fā)性風味物質(zhì)以及感官特性之間的相互關系做了研究，結(jié)果表明揮發(fā)性風味物質(zhì)、游離氨基酸、游離脂肪酸和奶酪的獨特風味緊密相關。Andersen［2］等人對成熟切達奶酪水溶性物質(zhì)中的滋味成分進行了研究，發(fā)現(xiàn)谷氨酸、礦物質(zhì)鹽和有機酸是主要的滋味成分。而國內(nèi)對奶酪中非揮發(fā)性風味物質(zhì)的研究較少，尚處于起步階段。馬玲［3］和鄭小平［4］分別對酸凝奶酪和霉菌奶酪的游離氨基酸進行了研究，而國內(nèi)對于奶酪中有機酸和游離脂肪酸的研究比較少見。

本研究旨在了解酸凝奶酪成熟過程中非揮發(fā)性風味物質(zhì)含量的變化規(guī)律，同時為評價其工藝和合理控制奶酪成熟過程提供理論依據(jù)，并對制作出營養(yǎng)美味的酸凝奶酪具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 試劑

0.01 mol/L H3PO4-NH2PO4緩沖液(pH=2.4)、乙腈、甲醇、H2SO4、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸、丹磺酰氯、冰乙酸、乙酸鈉、四氫呋喃、氨水、CH3CH2OH、乙醚、石油醚，以上試劑均為分析純，氨基酸混合標準液(色譜純)、37種脂肪酸甲酯混合標準品(色譜純)

1.2 設備

液相色譜儀，日本島津;氣相色譜儀，日本島津;冷凍離心機(Neofuge 15R)，力康發(fā)展有限公司;水浴鍋。

1.3 方法

菌種:乳酸乳球菌∶瑞士乳桿菌=1∶1。

牛奶:石河子大學動物科技學院實驗站提供。

酸凝奶酪加工工藝:原料乳的選擇→殺菌→添加乳酸菌發(fā)酵劑→發(fā)酵→切割→吊袋排乳清→入模成型→干燥→成品

1.3.1 有機酸測定方法

1.3.1.1 標準品混合液的配制

準確稱取甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸各0.500 0g，用超純水溶解后定容至50mL，此為標準儲備液，取5 mL儲備液定容至50 mL，為標準使用液。將標準使用液稀釋成5個不同的濃度梯度，峰面積采用外標法進行定量分析。

1.3.1.2 樣品預處理

準確稱取奶酪樣品0.5 g，研磨均勻后置于10 mL容量瓶，加8mL濃度為0.01 mol/L的H2SO4溶液振蕩30s后定容，離心(8 000 g)10 min，取清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待測。

1.3.1.3 色譜條件

流動相:甲醇和緩沖溶液(濃度為0.01 mol/L的NaH2PO4，pH=2.6)體積比為 3∶97，流速為 0.8 mL/min，紫外檢測波長為210 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。

1.3.2 氨基酸測定方法

(1)樣品處理:奶酪與去離子水以1∶2(m/V)混合，勻漿后50℃水浴保溫40 min，然后在4℃下4 000 r/min離心30 min，去除上層脂肪和下層沉淀，中層清液通過玻璃絨過濾后得到水溶性提取物。取250 μL 樣液，100 μL(2 moL/L)KHCO3，200 μL 4 g/L 丹酰氯丙酮，混勻后置于80～90℃水浴下40 min，取出后加入200 μL 1 mol/L HCl終止反應，冷卻，高速離心12 000 r/min，10 min。取上清液進樣測定。

(2)流動相 A:2.72 g乙酸鈉，180 μL三乙胺溶解于1L超純水中，再用1%冰醋酸調(diào)pH值為7.20，再加3.0 mL混合，用0.22 μm水系膜過濾。脫氣處理后于4℃下避光保存。

流動相B:2.72 g乙酸鈉加水至200 mL，用1%冰醋酸調(diào)pH值為7.20，加400 mL乙腈，400 mL甲醇混合，脫氣備用。

17種氨基酸標準溶液:復合氨基酸標準溶液，用0.01 mol/L HCl稀釋成不同濃度梯度，峰面積采用外標法進行定量分析。

色譜條件:色譜柱為C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫 40℃，進樣量:20 μL，流速 0.8mL/min，洗脫梯度:0～13 min(B:0% ～15%)，13～14 min(B:15% ～23%)，14～29 min(B:23% ～30%)，29～35min(B:30% ～35%)，35～38 min(B:35% ～40%)，38～45 min(B:40% ～68%)，45～55 min(B:68% ～70%)，55～57 min(B:70%)，57～60 min(B:70% ～0%)，60～62 min(B:0%)。

1.3.3 脂肪酸測定方法

(1)脂肪提取:參照GB 5413.27-2010。

(2)甲酯化:稱取脂肪50 mg于5 mL容量瓶中，加入1%H2SO4-甲醇2 mL，70℃水浴加熱30 min，加入2 mL正己烷，再加蒸餾水至瓶頸，取出上清液，再用1 mL正己烷洗1次，合并上清液，放入小瓶中待測。

(3)脂肪酸甲酯混合標準液用正己烷稀釋成不同濃度梯度，峰面積采用外標法進行定量分析。

(4)色譜條件:色譜柱為DM-Wax，30 m ×0.25 mm ×0.25 μm;進樣口溫度:250℃;檢測器溫度:280℃;升溫程序:50℃保持1 min，以25℃/min升至200℃，再以3℃/min升至240℃，保持18 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸凝奶酪成熟過程中有機酸含量變化

有機酸是大多數(shù)成熟奶酪中重要的風味成分，其含量和構(gòu)成適宜時，能賦予奶酪柔和的酸味，但是當其含量超過一定的閾值時，其酸味不協(xié)調(diào)。

表1顯示了酸凝奶酪成熟過程中有機酸含量的變化。分析可知，有機酸總量和各種有機酸含量變化都極顯著(P＜0.01)。隨著成熟時間的延長，有機酸總量持續(xù)積累，從第10天的7.84 mg/g增加到50天的15.51 mg/g。

表1 酸凝奶酪成熟過程中有機酸含量(mg/g)

乳酸在奶酪成熟過程中產(chǎn)生的主要有機酸，是由乳酸菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生的，它的含量與成熟時間是一致的。有研究表明，它在不同奶酪中的含量為1.94～17.4 mg/g［5］。在酸凝奶酪中檢測到大量的乳酸，成熟50 d的酸凝奶酪乳酸含量為10.75 mg/g，占總有機酸含量的69.31%，在上述結(jié)論范圍內(nèi)。

由表2可知，蘋果酸含量也是隨著成熟時間的延長而增加的，最終含量達到2.94 mg/g。

乙酸也是靠乳酸菌代謝乳糖產(chǎn)生的，或者由檸檬酸、乳酸代謝和氨基酸的代謝產(chǎn)生的。已有報道在很多奶酪中比如:Cheddar、Provolone等奶酪中乙酸的含量范圍是0.13 mg/g到2.96 mg/g。表2顯示酸凝奶酪成熟50 d時乙酸含量是0.95 mg/g。

檸檬酸含量在成熟50 d時是0.87 mg/g，在所有檢測到的有機酸中含量最低，Ong［6］認為可能是由于檸檬酸被微生物代謝生成了風味物質(zhì)，如乙酸、乙醛和雙乙酰。

2.2 酸凝奶酪成熟過程中氨基酸含量變化

游離氨基酸的形成可以認為是奶酪成熟和發(fā)酵劑適應性的標志，同時游離氨基酸影響奶酪的口味和余味。由表2可知，在酸凝奶酪成熟過程中氨基酸總量變化顯著(P＜0.05)，從第10天的75.48 mg/100 g增加到第50天的166.34 mg/100 g，說明隨著奶酪的成熟，它的營養(yǎng)價值也在不斷的提升，這一結(jié)果比馬玲［3］對酸凝奶酪和 R.Di Cagno［7］等人對意大利PDO 奶酪的測定值高，而比 Mangia［8］、Marta Bertolino［9］等人的研究結(jié)果低。

表2 酸凝奶酪成熟過程中游離氨基酸含量(mg/100g)

不同的奶酪氨基酸含量有明顯的變化，可能與奶酪的生產(chǎn)工藝(牛奶的衛(wèi)生狀況、牛奶的貯藏溫度、凝乳酶的添加量、乳清排出溫度、凝乳壓榨等)和成熟環(huán)境(貯藏類型、溫度、濕度)等因素有關［10］。在酸凝奶酪成熟第10天時，甘氨酸、組氨酸、精氨酸沒有檢測到;成熟20 d時，甘氨酸和精氨酸檢測到，只有組氨酸沒有檢測到，到奶酪成熟30 d時所有的氨基酸都能檢測到，說明隨著奶酪的成熟，氨基酸的種類在不斷地增加;到成熟50 d時幾乎所有構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸，包括7種必須氨基酸和10種半必須氨基酸都能檢測到。

從主要游離氨基酸的分布來看，在成熟10 d時，組氨酸、亮氨酸、酪氨酸是主要氨基酸，含量占總量的38.73%，在成熟50 d之后，主要游離氨基酸有纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，含量在總量的50.76%，成熟初期和成熟后期優(yōu)勢氨基酸相似，纈氨酸和亮氨酸一直是主要氨基酸，但有些氨基酸沒有一直處于主要氨基酸的狀態(tài)，這是由于微生物產(chǎn)生的酶使大分子肽水解成氨基酸和小分子肽。所有奶酪成熟期間游離氨基酸分布狀況決定于微生物的活性，當乳球菌和乳桿菌加入到奶酪中纈氨酸和亮氨酸就會大量存在［11］，而新疆特色酸凝奶酪采用的菌種就是乳酸乳球菌和瑞士乳桿菌，所以纈氨酸和亮氨酸含量較高。

從單個游離氨基酸在成熟期間變化趨勢來看，不同的氨基酸都以不同的方式進行積累，并不是所有的氨基酸含量都是在一直增加的。比如絲氨酸、谷氨酸含量都是先增加，之后一直處于下降趨勢，天冬氨酸含量在前30 d內(nèi)是增加的，40 d時下降，而到50 d時又增加，還有一些氨基酸如組氨酸和精氨酸在成熟初期沒有檢測到，成熟30 d后含量一直增加，這說明氨基酸含量一直處于動態(tài)變化的過程，有學者認為這與氨基酸的水解有關。

游離氨基酸種類和含量的增加有助于提高奶酪的營養(yǎng)價值，豐富奶酪的口感，并且游離氨基酸可以進一步分解生成揮發(fā)性風味物質(zhì)。

2.3 酸凝奶酪成熟過程中游離脂肪酸含量變化

表3 酸凝奶酪成熟過程中游離脂肪酸含量 mg/100g

游離脂肪酸在奶酪的基本味道上有重要作用，但如果游離脂肪酸含量過高會產(chǎn)生一些不快的氣味，因此奶酪生產(chǎn)過程中應控制游離脂肪酸含量。

表3顯示了酸凝奶酪成熟過程中游離脂肪酸含量的變化，可知游離脂肪酸總量變化差異極顯著(P＜0.01)，在成熟50 d內(nèi)，從139.35 mg/100 g增加到236.16 mg/100 g。和其他研究結(jié)果相比，比 Franco［11］對 Babia-Laciana奶酪研究得出的結(jié)果稍高，與Wit［12］等人對切達奶酪的研究結(jié)果相似。眾所周知，影響奶酪中游離脂肪酸含量的主要因素有:奶的種類和質(zhì)量、加熱處理、乳酸菌發(fā)酵劑的使用、成熟和貯藏溫度、鹽水濃度、奶中的脂肪酶以及建立于凝乳酶之上的脂肪酶。上述結(jié)論可能的解釋是:一方面，研究表明由羊奶制成的奶酪比牛奶制成的奶酪成熟過程中總游離脂肪酸含量低，這是由于羊奶中的脂蛋白酶只有一小部分與酪蛋白膠粒相連被留在奶酪中，還有可能是牛奶中酪蛋白和自身脂肪酶相互作用比羊奶要強［13］，酸凝奶酪和Wit等人研究的切達奶酪使用的是牛奶，而Babia-Laciana奶酪使用的是羊奶，由此可以印證這一結(jié)論。另一方面，本實驗奶酪貯藏溫度是10℃，和Wit等人采用的8～12℃相符，而與Franco等人的條件5℃有差別，有研究表明，貯藏在10～20℃的奶酪脂肪分解率比貯藏在5℃的要高。

從單一游離脂肪酸含量來看，并不是所有的游離脂肪酸都以相同的速率變化的，C4:0、C6:0、C8:0、C10:0、C12:0含量變化差異極顯著(P ＜ 0.01)，C14:0、C16:0、C18:1、C18:3含量變化差異顯著(P＜0.05)，只有 C18:2在成熟期間含量變化差異不顯著(P＞0.05)，M.De Wit等人得出C18:2含量變化差異不顯著的相同結(jié)果。短鏈脂肪酸(C4～C8)對奶酪特殊香氣的形成有重要影響，由表4可知，在整個過程中短鏈脂肪酸變化差異都極顯著，C4:0是主要的短鏈游離脂肪酸，Poveda，Cabezas［14］2006 年已報道。C14:0是主要的中鏈脂肪酸。中短鏈脂肪酸含量的增加利用人體消化利用，奶酪營養(yǎng)價值明顯提高。

從主要游離脂肪酸的分布來看，C18:1，C16:0，C14:0含量最高，占游離脂肪酸總量的56.64%，但它們對奶酪的風味并沒有貢獻。

3 結(jié)論

通過對新疆特色酸凝奶酪成熟過程中非揮發(fā)性風味物質(zhì)有機酸、游離氨基酸、游離脂肪酸含量變化的分析可知，有機酸含量隨著成熟時間的延長而增加，有機酸總量適中，賦予奶酪柔和的酸味，其中乳酸是主要的有機酸;而游離氨基酸種類隨著成熟時間的延長增加，總量變化顯著，提高了奶酪的營養(yǎng)價值，豐富了奶酪的口感，而單一氨基酸含量處于動態(tài)變化的過程;游離脂肪酸總量隨著成熟時間的延長而增加，短鏈脂肪酸含量顯著增加，中鏈脂肪酸含量也有所增加，更有利于人體消化吸收，使奶酪營養(yǎng)價值更高。

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