孔慶龍，樊建，趙天瑞

(昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明，650500)

塊菌(Truffle)又稱塊菇、松露、無娘藤、豬拱菌等，屬于子囊菌亞門塊菌目塊菌科塊菌屬，是地下真菌中的一個(gè)比較重要的子囊菌類群。子實(shí)體在土壤中生長(zhǎng)，除個(gè)別種類在成熟時(shí)半露出土表外，大部分種類自始至終埋生于地下，是與樹木共生的外生菌根型藥食兩用真菌［1-2］。塊菌的主要活性成分有α-雄烷醇、神經(jīng)酰胺、塊菌多糖等［3-4］。研究表明:塊菌多糖作為一種新的真菌多糖，具有水溶性好、毒性低、抑制腫瘤作用明顯等特征，有望開發(fā)成抗腫瘤藥物;此外，塊菌多糖作為一種新的真菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、消炎等良好的生物活性，為保健品和藥品的開發(fā)提供了新的原料［4-6］?，F(xiàn)有的多糖提取方法主要是酸提法、堿提法、超聲波輔助提取、酶輔助提取和水提法。酸提法會(huì)對(duì)多糖糖苷鍵造成破壞，堿提法會(huì)給后續(xù)的醇沉造成不良影響，超聲波和酶輔助法操作過程復(fù)雜。本文對(duì)熱水浸提法提取塊菌多糖，并對(duì)其進(jìn)行了抗氧化試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

印度塊菌(Tuber indicum):昆明食用菌所提供，產(chǎn)自云南，凍藏備用。

苯酚、濃 H2SO4、95%乙醇、葡萄糖、甲醇、DPPH、Na2HPO4、NaH2PO4、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、H2O2、FeSO4，均為分析純。

手提式高速粉碎機(jī)，溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司;分析天平(AL204型)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;恒溫水浴鍋(HH-4)，金壇市杰瑞爾電器有限公司;循環(huán)多用真空泵(SHZ-D(Ⅲ)型)，鞏義市英峪予華儀器廠;TU1901型雙光束紫外可見光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;飛鴿LXJ-ⅡB大容量離心機(jī)、TGL-16G冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖0.100 0 g于100 mL容量瓶中定容，制得1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硫酸-苯酚法［7］用移液管分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、6、8、10 mL，置于 50 mL 容量瓶中，加水至刻度，搖勻。再分別吸取上述溶液0.8 mL置于20 mL比色管中，以蒸餾水為空白對(duì)照，每個(gè)試管中加入新配制的5%的苯酚溶液0.8 mL，然后迅速加入濃硫酸5 mL，混合均勻后沸水浴30 min，冷卻至室溫。于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

1.2.3 水提法塊菌多糖的工藝流程

原料烘干→粉碎→過70目篩→稱重→浸提→抽濾→濾液→真空濃縮至原體積1/4→過夜醇沉→離心→沉淀→真空干燥→粗多糖

1.2.4 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確稱取過篩后的粉末0.5 g，按設(shè)定提取時(shí)間、溫度、液料比提取多糖，過濾取濾液定容至500 mL得到樣品溶液，精確吸取樣品溶液0.8mL，按1.2.2所述方法操作，將所測(cè)得的樣液的吸光值帶入回歸方程中，計(jì)算得出多糖產(chǎn)量從而得到塊菌多糖提取率。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

在其他條件都相同的情況下，分別考慮水浴時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h)、水浴溫度(50、60、70、80、90、100℃)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1)3個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由單因素試驗(yàn)確定的塊菌多糖熱水浸提法提取工藝的因素水平，利用Design Expert 8.0軟件，采用中心組合試驗(yàn)Box-Benhnken設(shè)計(jì)方案［8-9］。以自變量A、B、C分別表示提取時(shí)間、提取溫度、液料比3個(gè)單因素，以-1、0、1代表各因素的各水平值，按xi=(Xi-X0)/△X對(duì)自變量進(jìn)行編碼，xi為變量的編碼值，Xi為變量的實(shí)際值，X0為中心點(diǎn)變量的真實(shí)值，△X為變量的變化步長(zhǎng)，因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平

1.2.7 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定參照Blois［10］的方法稍作修改。將塊菌粗多糖配成不同濃度的溶液，分別取1mL不同濃度的多糖溶液至離心管中，再分別加入2mL 0.05mmol/L的 DPPH溶液，混合均勻，于25℃恒溫避光反應(yīng)30min，在517nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)x。同時(shí)以同體積甲醇和超純水分別取代DPPH溶液和多糖樣品作為調(diào)零，以同體積的超純水代替多糖溶液作為空白對(duì)照組A0，并為了消除多糖溶液自身吸光值影響，以同體積甲醇代替DPPH作為樣品對(duì)照組Ax0。清除率由下面公式得:

1.2.8 羥基自由基清除能力測(cè)定

羥基自由基清除能力測(cè)定參照Smirnff［11］的方法稍作修改。將塊菌粗多糖配成不同濃度的溶液備用。在離心管中依次加入1mL 9 mmol/L FeSO4、1mL不同濃度的多糖溶液、1mL 9 mmol/L H2O2搖勻靜置10 min，再加入1mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液搖勻，于37℃保溫 30 min，冷卻至室溫，5 000 r/min離心10min，取上清液在510 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)x。以等體積水代替多糖為空白對(duì)照組測(cè)吸光值A(chǔ)0，以等體積水代替水楊酸為樣品對(duì)照組測(cè)吸光值A(chǔ)X0，蒸餾水調(diào)零。清除率由下面公式得:

1.2.9 還原力測(cè)定

還原力測(cè)定參照Yen等［12］的方法修改。將塊菌粗多糖配成不同濃度的溶液備用。在離心管中依次加入1 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液、1 mL不同濃度的多糖溶液、1 mL 1%鐵氰化鉀溶液于50℃水浴20 min，再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸，冰水冷卻，5 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL再加入1 mL超純水和0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵，反應(yīng)10 min后于700 nm處測(cè)吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素對(duì)塊菌多糖提取率的影響

影響塊菌多糖提取率的因素有很多，如提取時(shí)間、提取溫度、液料比等。在進(jìn)行RSM分析前，應(yīng)先進(jìn)行單因素試驗(yàn)來確定試驗(yàn)因素與水平。

2.1.1 提取時(shí)間的影響

確定液料比為60∶1(mL∶g)，提取溫度為90℃，提取時(shí)間分別為 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h。分別測(cè)定多糖含量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、多糖提取率為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，在1～4 h內(nèi)多糖提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯提高，提取率在2 h前增加明顯，之后趨于平緩，3.5 h后幾乎持平。說明多糖的浸出過程與時(shí)間密切相關(guān)，時(shí)間過短，細(xì)胞溶脹性不好且多糖溶解不充分;時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使已經(jīng)溶出的多糖結(jié)構(gòu)的變化而使提取率降低。因此，為縮短工時(shí)減少能耗，所以選取3.5 h為響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)中時(shí)間因素3個(gè)水平的中間值。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.1.2 提取溫度的影響

確定液料比為60∶1(mL∶g)，提取時(shí)間為2 h，提取溫度分別為 50、60、70、80、90、100℃。分別測(cè)定多糖含量，以提取溫度為橫坐標(biāo)、多糖提取率為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖3所示。從圖3知，在一定范圍內(nèi)提取溫度與多糖提取率成正相關(guān)。在50～90℃內(nèi)多糖提取率隨溫度的升高而顯著增加，可能原因是隨著溫度的升高，細(xì)胞溶脹度增大，傳質(zhì)強(qiáng)化，從而使得多糖的溶出率增加。而在90℃以后的多糖提取率略有降低，可能原因是溫度過高時(shí)粗多糖的糖苷鍵發(fā)生水解，多糖降解成單糖或寡糖，從而使粗多糖得率有所降低?？紤]到高溫可能對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和活性造成影響，且高溫更加耗能，因此選取90℃為響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)溫度因素3個(gè)水平中的中間值。

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.1.3 液料比的影響

確定提取溫度為90℃，提取時(shí)間為3.5h，設(shè)定液料比(mL∶g)分別為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1。分別測(cè)定多糖含量，以液料比為橫坐標(biāo)、多糖提取率為縱坐標(biāo)繪制曲線，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，當(dāng)液料比為10∶1～30∶1時(shí)，多糖提取率隨液料比的增加十分明顯，在液料比為50∶1時(shí)提取率達(dá)到最高，而當(dāng)液料比繼續(xù)增加時(shí)多糖提取率變化并不明顯，因此估計(jì)當(dāng)液料比為50∶1時(shí)已經(jīng)將多糖充分溶出。液料比較小不利于原料中多糖的溶出，而液料比過高不僅會(huì)增大試劑的消耗量，而且不利于后期的分離濃縮。綜合考慮產(chǎn)品得率、試劑消耗及后續(xù)處理，選取50∶1(mL∶g)為響應(yīng)曲面優(yōu)化設(shè)計(jì)中液料比因素的中間水平。

圖4 液料比對(duì)多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果分析

利用Design Expert 8.0軟件，采用中心組合試驗(yàn)Box-Benhnken設(shè)計(jì)方案方案，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面工藝優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)共設(shè)共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，包括12個(gè)析因點(diǎn)和3個(gè)中心點(diǎn)。結(jié)果如表2所示。其中試驗(yàn)號(hào)1～12是析因試驗(yàn)，試驗(yàn)號(hào)13～15是中心試驗(yàn)。利用Design Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，經(jīng)回歸擬合后，各因素與響應(yīng)值的回歸方程為:模型的方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 變量方差分析表

由方差分析可知，模型的F值為59.54、P值為0.000 1，說明模型顯著，失擬項(xiàng)F值為7.16說明差異不顯著，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響小。該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)平方R2=0.990 8，修正相關(guān)系數(shù)平方=0.974 1，變異系數(shù)CV/%=0.64，這說明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臄M合程度良好，能夠很好地描述試驗(yàn)的結(jié)果，自變量和響應(yīng)值之間呈現(xiàn)顯著的線性關(guān)系，試驗(yàn)誤差較小，模型方程可以很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值，可用此模型來分析和預(yù)測(cè)水提塊菌多糖的工藝結(jié)果。同時(shí)能夠得知 A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2等 8 項(xiàng)試驗(yàn)因子對(duì)多糖提取率影響顯著，且各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。根據(jù)方差分析和回歸方程，得到三維響應(yīng)面曲面圖，如圖5所示。

由RSM得到的三維圖形直觀的反應(yīng)了各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響，其形狀也可以反應(yīng)出交互作用的強(qiáng)弱。由圖5可知在一定范圍內(nèi)塊菌多糖的提取率隨著提取時(shí)間和溫度的升高而升高，兩者交互作用顯著，同時(shí)可以看出提取溫度對(duì)提取率影響的顯著性大于提取時(shí)間;在一定范圍內(nèi)塊菌多糖的提取率隨著提取時(shí)間和液料比的升高而升高，兩者交互作用顯著，且提取時(shí)間對(duì)提取率影響的顯著性大于液料比;提取溫度與液料比的交互作用效果不顯著，且提取溫度的影響顯著性大于水料比。圖5顯示，3個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響以及各因素之間的交互影響與回歸分析結(jié)果吻合。

圖5 不同因素及其相互作用對(duì)塊菌多糖提取率影響的響應(yīng)曲面圖

2.2.2 響應(yīng)面的優(yōu)化

通過軟件優(yōu)化器對(duì)熱水浸提法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到塊菌多糖提取的最佳工藝條件、理論最大提取率并進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)綜合考慮實(shí)際情況和試驗(yàn)條件，選擇工藝條件參數(shù)為提取時(shí)間3.7h，提取溫度95℃，液料比59∶1(mL∶g)，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得塊菌多糖的提取率為10.73%、10.78%、10.75%，平均值為10.75%，與理論值的比較誤差為0.06%。由此可見，應(yīng)用RSM法得到的優(yōu)化工藝參數(shù)是準(zhǔn)確可靠的。

2.3 抗氧化能力

抗氧化能力使用EC50來進(jìn)行評(píng)價(jià)。試驗(yàn)中的EC50值指當(dāng)DPPH、羥基自由基清除率分別為50%時(shí)所需樣品的濃度，還原力試驗(yàn)中700nm處吸光值為0.5時(shí)的樣品濃度。

2.3.1 DPPH自由基清除能力及羥基自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的結(jié)果如圖6所示。研究結(jié)果表明塊菌多糖具有清除DPPH自由基的活性，其清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，隨著提取物濃度的增加樣品對(duì)DPPH的清除率也隨之增加，當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到95%，其 EC50值為1.12 mg/mL。

圖6 塊菌多糖DPPH和羥基自由清除能力

圖6 還顯示，塊菌多糖具有清除羥基自由基的活性，其清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，隨著提取物濃度的增加樣品對(duì)羥基自由基的清除率也隨之增加，當(dāng)濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到93%，其 EC50值為0.73 mg/mL。

2.3.2 還原力

塊菌多糖還原力測(cè)定結(jié)果如圖7所示。研究結(jié)果表明塊菌多糖具有一定的還原力，其還原能力呈現(xiàn)出劑量依賴性，隨著提取物濃度的增加還原力也隨之增加，其EC50值為2.46 mg/mL。

圖7 塊菌多糖的還原能力

3 結(jié)論

采用熱水浸提法提取塊菌多糖的工藝優(yōu)化條件為:時(shí)間3.71 h，溫度 94.68℃，液料比 58.66∶1(mL∶g)。綜合考慮實(shí)際情況和試驗(yàn)條件，選擇工藝條件參數(shù)為提取時(shí)間3.7 h，提取溫度95℃，液料比59∶1(mL∶g)。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得塊菌多糖的提取率平均值為10.75%，與預(yù)測(cè)值接近，證明試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析方法可靠。

通過對(duì)塊菌抗氧化活性的研究，得知塊菌有較強(qiáng)的DPPH自由基和羥基自由基清除能力和較好的還原能力。表明塊菌多糖對(duì)人體的氧化損傷有一定的保護(hù)作用，為以后塊菌相關(guān)關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的參考和依據(jù)。

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