李晨曦，范青生，姜興華，余宙

(南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西南昌，330047)

蛹蟲草(Cordyceps militaris)，又名北冬蟲夏草，蛹草，蛹草菌等，為衛(wèi)生部公布的新資源食品，分類學(xué)上屬于真菌門(Eumycota)，子囊菌亞門(Ascomycotinia)，核菌綱(Pyrenomycetes)，球殼目(Sphaeriales)，麥角菌科(Claviciptiaceae)，蟲草屬(Cordycps)［1］。研究表明蛹蟲草含有豐富的蛋白質(zhì)，有的甚至高達(dá)39%，人體必需氨基酸的種類齊全、比例適當(dāng)，占氨基酸總量的 35.47%;同時含有 VA，VB2，VE，VC，VB1，VD，VB6和菸酸［2］，以及含有蟲草素、蟲草多糖、腺苷、甘露醇、麥角甾醇等藥理成分［3］。臨床研究表明，蛹蟲草具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗腫瘤［4-5］、抗衰老、耐缺氧、降血壓、降血脂、鎮(zhèn)靜催眠、保護(hù)心腦組織等藥理作用［6-7］。

蛹蟲草的粗蛋白含量在30%左右，而對蛹蟲草相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)主要是利用其蟲草素、腺苷等功效成分，對于蛹蟲草蛋白質(zhì)的提取性研究報道及市場上出現(xiàn)的針對蛹蟲草蛋白進(jìn)行研究開發(fā)的產(chǎn)品卻并不多見，本文采用響應(yīng)曲面法對蛹蟲草蛋白質(zhì)的提取進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

蛹蟲草子實體，惠州市鑫福來實業(yè)發(fā)展有限公司;牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，廣東市齊云生物技術(shù)有限公司，純度≥97%;考馬斯亮藍(lán)G250，上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司;NaOH、乙醇、85%H3PO4、HCl，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純。

DFT-200型中藥粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司;AR2140型分析天平，奧豪斯公司;DK-S 24型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司;PB-10型pH計，德國賽多利斯;TL-04型離心機(jī)，北京路科順科技發(fā)展有限公司;KDY-9820凱氏定氮儀，廈門精藝興業(yè)公司;普析通用T6新世紀(jì)紫外分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析測定

(1)粗蛋白含量的測定［8］:凱氏定氮法。

(2)蛋白質(zhì)檢測:Bradford 檢測方法［9］。

將提取液稀釋10倍，取0.25 mL的提取液，補(bǔ)充水到1 mL，加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G250試劑，搖勻靜置10 min，在紫外分光光度計595 nm波長下測定吸光值，計算蛋白得率:

蛋白得率/%=(提取液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量/原料蛹蟲草的質(zhì)量)×100

1.2.2 蛹蟲草蛋白提取工藝

將蛹蟲草子實體粉碎成粉末，過80目篩，用一定量一定濃度NaOH溶液浸提一段時間后，在3 500 r/min條件下離心30 min。取濾液透析后調(diào)節(jié)等電點，在3 000 r/min條件下離心20 min得沉淀。將沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥得到粗蛋白。

1.2.3 蛋白提取工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗

確定堿液濃度、提取時間、提取溫度、料液比4個因素，每個因素進(jìn)行6水平梯度處理，以蛋白得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實驗研究分析。

1.2.3.2 Box-Behnken實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，確定三因素三水平的最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料蛹蟲草中粗蛋白的含量

經(jīng)過凱氏定氮法測定所選取的蛹蟲草中粗蛋白的含量為28.7%。

2.2 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果表明，蛋白吸光度值在15～150 μg/mL濃度內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為:Y=5.413 8X+0.036 2，R2=0.997 9。

經(jīng)過精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、重復(fù)性實驗、加樣回收率實驗表明，該方法用于測定蛹蟲草中的蛋白質(zhì)含量可靠、穩(wěn)定。

2.3 單因素實驗結(jié)果與分析

2.3.1 NaOH溶液的濃度對蛹蟲草蛋白得率的影響

圖2 NaOH溶液的濃度對蛹蟲草蛋白得率的影響

由圖2可知，隨著堿液濃度的不斷增加，蛋白提取的效果增強(qiáng)。當(dāng)堿液濃度到達(dá)0.15 mol/L時，蛋白質(zhì)的得率最大達(dá)到8.56%，而當(dāng)堿性過強(qiáng)時，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變質(zhì)使其得率下降。故在其他工藝條件一定的情況下，綜合考慮產(chǎn)量與質(zhì)量等因素，蛋白質(zhì)得率在NaOH溶液濃度為0.15 mol/L的條件下最佳。因此選取0.1，0.15，0.2 mol/L 3個水平為考察因素。

2.3.2 浸提時間對蛹蟲草蛋白得率的影響

由圖3可知，提取時間較短時，蛹蟲草粉不能與NaOH充分接觸，蛋白質(zhì)不易分離，從而提取物少，隨著提取時間的延長，蛋白的提取率會不斷增加。在120分鐘時最大，得率為8.21%。此后隨著時間的增加，對蛋白提取率的影響不顯著，說明蛋白質(zhì)已經(jīng)充分溶出。因此選取90，120，150 min 3個水平為考察因素。

圖3 浸提時間對蛹蟲草蛋白得率的影響

2.3.3 料液比對蛹蟲草蛋白得率的影響

圖4 料液比對蛹蟲草蛋白得率的影響

由圖4可知，隨著料液比的提高，蛹蟲草的蛋白提取率明顯升高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶17.5時，蛋白得率最高為8.66%，因此選取 1∶15，1∶17.5，1∶20 三個水平作為考察因素。

2.3.4 提取溫度對蛹蟲草蛋白得率的影響

圖5 提取溫度對蛹蟲草蛋白得率的影響

由圖5可知，溫度在一定范圍內(nèi)對蛋白質(zhì)的提取有促進(jìn)作用，當(dāng)提取溫度低于50℃，蛋白得率隨溫度的升高而升高，而當(dāng)溫度在50～70℃時，其對蛋白質(zhì)的提取率影響不大，50、60、70℃的提取率分別為8.43%、8.56%、8.61%，溫度超過70℃時，蛋白提取率逐漸降低，可能是溫度過高，使溶液的粘度變大，分子的運動速度減慢，阻止蛋白質(zhì)溶解到溶液中，從而使提取率下降。而且，蛋白質(zhì)在長時間熱的影響下易變性，由于疏水基團(tuán)的暴露和展開，蛋白質(zhì)分子聚集，使蛋白質(zhì)溶解度下降，導(dǎo)致蛋白提取率下降。從工業(yè)生產(chǎn)節(jié)省資源和生產(chǎn)力的角度考慮，固定選取60℃，進(jìn)行之后的響應(yīng)曲面實驗，不對其進(jìn)行與其他因素的進(jìn)一步交叉優(yōu)化實驗。

2.4 響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化提取工藝

單因素實驗后，選取堿液濃度、料液比、浸提時間3個條件進(jìn)行Box-Behnken實驗，分別以A、B和C代表，每個自變量的低、中、高試驗水平編碼分別為-1、0、1(見表1)。

表1 試驗因素水平及編碼

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計以及蛋白得率的實測值與預(yù)測值

利用Design Expert軟件，通過對表2中的數(shù)據(jù)分析得到蛋白得率試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得蛹蟲草蛋白得率對編碼自變量的二次多項回歸方程:

蛹蟲草蛋白得率(Y)/%=8.65-0.42A-0.49B-0.11C+0.79AB-1.08AC-0.18BC-2.03A2-0.73B2-0.53C2。

表3為回歸分析結(jié)果，由該模型的方差顯著性分析可知，本試驗所選用的二次多項模型具有極高的顯著性(PModel＜0.000 1)，失擬項不顯著，其校正決定系數(shù))為0.984 8，表明有約98.48%的蛋白得率變化能由此模型解釋。相關(guān)系數(shù)(R2)為0.993 4，表明堿法提取蛹蟲草蛋白得率的實測值與預(yù)測值之間具有較好的擬合度，可用于堿法提取蛹蟲草蛋白質(zhì)的分析和預(yù)測。

表3 蛋白得率回歸方程顯著性檢驗

回歸方程中各因素的系數(shù)值可以直接反映各試驗因子對指標(biāo)值的影響程度，F(xiàn)值越大，表明該因素越重要。從表3可以看出，影響堿法提取蛹蟲草蛋白得率主次順序為:料液比＞堿液濃度 ＞浸提時間。

根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)曲面分析圖(圖6～圖8)，考察所擬合的圖形的形狀，分析堿液濃度、料液比、浸提時間對蛹蟲草蛋白質(zhì)的提取得率的影響。

圖6 堿液濃度和料液比交互影響蛹蟲草蛋白得率的曲面圖

從圖6可以看出，隨著堿液濃度的增大和料液比的提高，蛋白得率也隨之增大，達(dá)到一個最高點后，又逐漸減小。從圖7、圖8可以看出，浸提時間和堿濃度以及浸提時間和料液比有著同圖6一樣的趨勢，這也說明所要找的最佳浸提時間、堿液濃度和料液比都在設(shè)定的試驗范圍內(nèi)。圖6～圖8表明，該模型在試驗范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點，且該穩(wěn)定點是最大響應(yīng)值。

圖7 浸提時間和堿液濃度交互影響蛹蟲草蛋白得率的曲面圖

圖8 浸提時間和料液比交互影響蛹蟲草蛋白得率曲面圖

分析得到，堿法提取蛹蟲草蛋白質(zhì)的最佳工藝條件為，提取時間128 min，料液比1∶16.2，NaOH 溶液的濃度0.14 mol/L。試驗重復(fù)3次，驗證蛋白質(zhì)的得率為88.92 mg/g與預(yù)測值88.19 mg/g接近。充分驗證了所建模型的正確性。

3 結(jié)論

采用堿法提取蛹蟲草蛋白，通過單因素實驗和Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，依靠響應(yīng)曲面分析優(yōu)化提取工藝，擬合了浸提時間、料液比和堿液濃度3個因素對蛹蟲草蛋白得率的回歸模型，通過驗證該模型能夠較好預(yù)測蛹蟲草蛋白得率。得到最佳的提取條件，提取時間128 min，料液比1∶16.2，NaOH 溶液的濃度0.14 mol/L，在此條件下實驗得到蛋白得率為88.92 mg/g。

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