陳蓮君 徐德平

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

油菜蜂花粉中黃酮的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

陳蓮君 徐德平

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

研究油菜蜂花粉黃酮的組成，采用乙醇提取，石油醚萃取脫脂和柱層析分離方法對(duì)油菜蜂花粉黃酮進(jìn)行研究，得3個(gè)黃酮類化合物，經(jīng)1H－NMR、13C－NMR，分別鑒定出3個(gè)黃酮類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)為山奈酚－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、山奈酚－3－O－β－D吡喃葡萄糖基（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷和槲皮素－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，與 HPLC－ MS檢測(cè)結(jié)果一致。

油菜蜂花粉；黃酮；分離；結(jié)構(gòu)鑒定；HPLC－MS；核磁共振；質(zhì)譜分析

油菜（Brassica campestris L.）是十字花科植物油菜的嫩莖葉，原產(chǎn)中國(guó)，為中國(guó)大面積種植的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物。花粉（pollen）是植物有性生殖的雄性配子體，它濃縮了植物界所有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被人們譽(yù)為“最完美的食物”。蜂花粉則是蜜蜂采集的花粉加入花蜜和唾液形成的粒狀物，因此，又被人們譽(yù)為“微型營(yíng)養(yǎng)庫(kù)”［1］。油菜蜂花粉除了含有多種氨基酸、維生素和微量元素以及大量的蛋白酶、核酸等活性物質(zhì)外，還含有大量黃酮類化合物，尤其黃酮苷的含量更高［2］。據(jù)報(bào)道［3－6］，生物類黃酮具有多種活性，包括延緩衰老，治療和預(yù)防癌癥、心血管病，抑制前列腺疾病，降血糖，降血脂和防輻射等作用。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)油菜蜂花粉中的黃酮研究雖然較多，但并不系統(tǒng)。本試驗(yàn)利用HPLC－MS首先確定油菜蜂花粉中黃酮的基本組成，再通過多種方法對(duì)主要組分進(jìn)行分離并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，從而為油菜蜂花粉的活性研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉：南京老山藥業(yè)有限公司；

聚酰胺：浙江省臺(tái)州化工廠；

ODS柱填料：進(jìn)口分裝；

GF254硅膠板：山東煙臺(tái)芝罘化工廠；

無水乙醇、丙酮、硫酸、茴香醛、冰醋酸、甲醇、石油醚（30～60℃）、正丁醇：分析純，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站；

其它試劑：均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE52CS，上海亞榮生化儀器廠；

中藥粉碎機(jī)：WFJ8－20，江陰市靈杏藥化設(shè)備有限公司；

暗箱式紫外透射儀：ZF－90，上海顧村電光儀器廠；

恒流泵：HL－2，上海滬西分析儀器廠有限公司；

核磁共振儀：Brucker AVance500，中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所；

質(zhì)譜儀：LCQ型，美國(guó)Thermo－Finnegan公司；

氣相色譜儀：GC－17AATF，日本島津公司；

循環(huán)水多用真空泵：SHB－III，鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－4，江蘇省金壇市榮華儀器廠。

1.3 油菜花粉中黃酮的提取

稱取油菜蜂花粉8kg，粉碎后過80目篩，以75%乙醇為溶劑［7］，1∶5（m∶V）的料液比，回流提取2h，過濾出清液，渣再重復(fù)提取2次，合并清液減壓濃縮至無乙醇時(shí)止。用石油醚脫脂多次，至石油醚液無色為止。取脫脂后的液體再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至無石油醚時(shí)止，再加95%乙醇使乙醇濃度為70%，4℃靜置12h，取上清液濃縮至無醇味，得油菜蜂花粉黃酮粗提物。

1.4 油菜蜂花粉黃酮組成分析

取油菜蜂花粉黃酮粗提物適量，加色譜純甲醇溶解用于HPLC分析。

色譜條件［8］：Waters600／2410色譜柱；流動(dòng)相為V（甲醇）∶V（水）＝60∶40；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；流速1mL／min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10μL。

1.5 油菜蜂花粉黃酮的分離和純化

將油菜蜂花粉粗提物加適量蒸餾水稀釋，過聚酰胺柱（60mm×100cm），流速10mL／min經(jīng)，依次用去離子水、10%，30%，50%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，每梯度洗脫1 000mL，洗出液分步收集，TLC薄層檢測(cè)。根據(jù)Rf值和顯色反應(yīng)，初步分為A、B和C 3個(gè)組分。將3個(gè)組分分別反復(fù)上ODS色譜柱，最終得到3種純的化合物，分別為I，II，III。

1.6 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

將化合物I、II和III樣品用DMSO－d6溶解后進(jìn)行1HNMR和13C－NMR分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 油菜花粉黃酮組成

油菜花粉的黃酮粗提物經(jīng)HPLC－MS檢測(cè)結(jié)果見圖1。由圖1可知，3個(gè)主峰出峰時(shí)間分別為4.07，4.44，4.61min，推測(cè)油菜花粉中主要由3種黃酮組成。保留時(shí)間為4.07min的峰的分子量為610，保留時(shí)間為4.44min的峰的分子量為464，保留時(shí)間為4.61min的峰的分子量為448。從分子量和碎片裂解方式來看這3個(gè)峰對(duì)應(yīng)的都是黃酮類物質(zhì)，但具體是哪3種黃酮還需要進(jìn)一步確定。

圖1 油菜蜂花粉黃酮HPLC譜圖（254nm）Figure 1 HPLC spectrum of flavonoids in bee pollen rape（254nm）

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)解析

2.2.1 化合物I 淡黃色粉末，鹽酸－鎂粉反應(yīng)顯紫紅色，濃硫酸反應(yīng)顯黃色，可溶于甲醇、乙醇。由圖2（a）可知，該化合物的分子量為610。

從1H－NMR譜可見δ8.13和7.16處各有2個(gè)H，其偶合常數(shù)值均為7.2，表明這4個(gè)H處于對(duì)位取代苯環(huán)上。δ6.46和6.23處各有1個(gè) H，其偶合常數(shù)為2.0，說明這2個(gè)H為苯環(huán)上的間位H。δ5.48和5.38處各有2個(gè)H，推測(cè)這2個(gè)H應(yīng)為糖上的端基H，說明存在2個(gè)糖基。δ3.2～4.8為糖上其余H的信號(hào)。

圖2 液相色譜中各峰質(zhì)譜（ES＋）圖Figure 2 Mass spectrum of Liquid chromatography

從13C－NMR譜上可見該化合物共有27個(gè)碳，其中有12個(gè)糖的碳信號(hào)，從余下的15個(gè)碳信號(hào)來看，應(yīng)為黃酮類化合物，且δ133.8的碳信號(hào)表明化合物I為黃酮醇類物質(zhì)。綜合分析其波普數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)［9］、［10］中山奈酚－3－O－β－D吡喃葡萄糖基（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷的數(shù)據(jù)一致，故化合物I鑒定為山奈酚－3－O－β－D吡喃葡萄糖基（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)式見圖3。

2.2.2 化合物II 淡黃色粉末，鹽酸－鎂粉反應(yīng)顯紫紅色，濃硫酸反應(yīng)顯黃色，可溶于甲醇、乙醇。由圖2（b）可知，該化合物分子量為464。

從1H－NMR譜可見δ7.96，7.95處各有一個(gè) H，為dd峰，其偶和常數(shù)為7.6和1.8。δ7.81處有一個(gè)H，偶合常數(shù)為7.6，從這些數(shù)據(jù)可得這3個(gè)H為同一苯環(huán)上的3個(gè)H。δ7.96與7.68處的二個(gè)H為鄰位關(guān)系。δ7.96與7.81處的H為間位。δ6.51和6.26處存在2個(gè)H，其J值為2.0。表明這2個(gè)H為苯環(huán)上的2個(gè)間位H。δ5.61處有1個(gè)H，判斷該H為糖上端基H，δ3.4～4.8處為糖上其余H的信號(hào)。從以上數(shù)據(jù)可以推測(cè)出物質(zhì)II為槲皮素－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷，與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的槲皮素－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷數(shù)據(jù)一致?；衔锝Y(jié)構(gòu)式見圖3。

2.2.3 化合物III 淡黃色粉末，鹽酸－鎂粉反應(yīng)顯紫紅色，濃硫酸反應(yīng)顯黃色，可溶于甲醇、乙醇。由圖2（c）可知，該化合物的分子量為448。

從該化合物的1H－NMR譜可知δ8.07處有2個(gè)H，偶合常數(shù)為8.9，δ6.93處有2個(gè)H，其J值為8.9，表明這4個(gè)H位苯環(huán)上的AA′BB′系統(tǒng)的H，說明有對(duì)位取代苯的出現(xiàn)。δ6.44和6.20處各有2對(duì)H，J值都為2.0。表明這2個(gè)H為同一苯環(huán)體系中的間位H。δ5.68處有一個(gè)H，這為糖的端基質(zhì)子，從其偶合常數(shù)7.1來看，該糖為β構(gòu)型。δ3.4～4.8為糖上其余H的信號(hào)。

綜合判斷該化合物為黃酮類物質(zhì)，與文獻(xiàn)［12］、［13］所報(bào)道的山奈酚－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷的數(shù)據(jù)一致?；衔锝Y(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 化合物I、II、III的結(jié)構(gòu)Figure 3 Structure of compound I、II、III

3 結(jié)論

采用75%乙醇回流提取，石油醚脫脂，經(jīng) HPLC－MS分析得出蜂花粉中的黃酮主要有3種成分，然后再經(jīng)聚酰胺柱色譜和ODS柱色譜層析，從油菜花粉中分離得到3種黃酮化合物，證實(shí)了HPLC－MS的檢測(cè)分析。并且通過核磁共振和質(zhì)譜分析，與相關(guān)文獻(xiàn)［9－13］對(duì)照，鑒定其為山奈酚－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、山奈酚－3－O－β－D吡喃葡萄糖基（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷和槲皮素－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷。

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Separation purification and structure elucidction of flavonoids from rape pollen

CHEN Lian－jun XU De－ping

（Food College of Jiang Nan University，Wuxi，Jangsu214122，China）

Bee－collected rape pollen extracted with 75%EtOH，and the mixture was suspended in H2O and was extracted and degreased successively with petroleum ether.The compounds were isolated by polyamide column chromatography and Octadecyl silane chemically bonded to silica gel column chromatography.Three compounds were isolated from Bee－collected rape pollen and were determined by1HNMR、13C－NMR、MS.The structures of them were kaemferol－3－O－β－D－glucoside、kaemferol－3－O－β－D－glucosyl－（2→1）－β－D－glucoside and quercetin－3－O－β－D－glucoside.

rape pollen；flavonoids；separation purification；structure elucidation；HPLC－MS；NMR；mass spectrometry

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.033

陳蓮君（1988－），女，江南大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：c＿l＿jhappy＠sohu.com

2012－01－15