安 卓 賈昌喜

（北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，北京 102206）

大孔樹脂分離純化苦苣菜黃酮的工藝研究

安 卓 賈昌喜

（北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，北京 102206）

研究大孔樹脂純化苦苣菜黃酮的條件。利用靜態(tài)吸附方法篩選純化苦苣菜黃酮的最適大孔樹脂，利用動態(tài)吸附方法研究最適大孔樹脂純化苦苣菜黃酮的條件。結(jié)果表明，大孔樹脂AB－8對吸附苦苣菜黃酮的效果最好，最佳純化條件：上樣液濃度為3.73%，上樣液速率為3.6mL／min，上樣液pH 5.18；用78.20%的乙醇溶液、以120mL 2.88mL／min的速率洗脫。利用大孔吸附樹脂AB－8在上述最佳條件下，吸附率可達(dá)84.32%；解吸率91.73%。

大孔樹脂；靜態(tài)吸附；動態(tài)吸附；苦苣菜；黃酮

菊科苦苣屬中，苦苣（sonchus oleraceus L.）屬于1年至2年生的草本植物，或稱做苦荬菜、苣荬菜［1］?？嘬牟酥芯哂星鄄怂?、木犀草素、苷類等黃酮類物質(zhì)［2］，具有優(yōu)良的藥用價(jià)值以及食用價(jià)值，而且分布廣泛［3］?？嘬牟它S酮類物質(zhì)能顯著改善試驗(yàn)性肝損傷，從其提取的酸性物質(zhì)能顯著對抗腫瘤［4，5］。大孔樹脂（macroporous resin）是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物，具有吸附容量大、吸附速度快、解吸條件溫和、易于再生、使用壽命長等優(yōu)點(diǎn)［6］，是近十幾年發(fā)展起來的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑，已廣泛應(yīng)用于各種植物和中草藥黃酮類化合物的分離純化過程［7－9］，樹脂本身的性質(zhì)不同程度地影響著分離純化效果［10－12］。本試驗(yàn)旨在尋找一種適合苦苣菜黃酮純化的大孔吸附樹脂，并研究出最佳純化條件，為制備高純度的苦苣菜黃酮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

苦苣菜：2011年8月采于北京龐各莊，于120℃干燥至恒重后，粉碎過40目篩，得苦苣干粉，密封包裝后置于干燥皿中避光保存；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑：分析純，上海試劑二廠；

無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：分析純，北京化學(xué)試劑公司；

大孔 樹 脂：AB－8，D－101，HPD－100，LX－60，LSA－21，NKA，XDA－7，XAD－16，北京九州同業(yè)生物科技有限公司。

紫外－可見分光光度計(jì)：UV 765CRT，上海精研有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ－700E型，昆山市超聲儀器有限公司；

中草藥粉碎機(jī)：KS－80，天津泰斯特儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：R－201，上海申生科技有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG－9076A，天津泰斯特儀器有限公司；

精密pH計(jì)：PHS－3C型，上海第三分析儀器廠；

電子天平：BT125D，賽多利斯北京公司；

臺式低速離心機(jī)：L530，湖南赫西儀器裝備有限公司；

臺式冷凍恒溫振蕩器：THZ－C－1，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；

恒流泵：HL－Z，上海滬西分析儀器廠有限公司；

自動部分收集器：BSZ－100，上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮粗提液的制備 稱取4.00g苦苣菜干粉，加入40mL乙醇溶液充分溶解，按照乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時(shí)間3.33h、提取溫度84℃、料液比1∶50（m∶V）的條件，采用乙醇回流提取法提取，收集提取液，抽濾，得到苦苣菜黃酮粗提取液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)文獻(xiàn)［13］制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度C（mg／mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，得回歸方程A＝1.180 1C＋0.009 4，R2＝0.999 9。

1.2.3 測定樣品中黃酮濃度 精密稱取定量提取液，按1.2.2節(jié)操作，在波長510nm處測定其吸光度，由回歸方程計(jì)算樣品中黃酮濃度（mg／mL）。

1.2.4 大孔樹脂的預(yù)處理 首先用去離子水沖洗大孔樹脂以除去其雜質(zhì)，再將樹脂用95%乙醇充分浸泡24h，使其充分溶脹，后裝入玻璃層析柱，以一定流速使用無水乙醇洗滌大孔樹脂，直到完全去除流出液中醇溶雜質(zhì)，再以濃度為4%的稀鹽酸浸泡樹脂，以去離子水洗滌樹脂使其pH值為中性，最后以濃度為2%的氫氧化鈉浸泡樹脂，以去離子水洗滌樹脂使其pH值為中性。

1.2.5 樹脂的靜態(tài)吸附和解吸率的測定 精確稱取已處理好的8種樹脂 HPD－100、D101、AB－8、NKA、LX－60、XDA－7、LSA－21、XAD－16各1g（干質(zhì)量），分別置于8個(gè)50mL具塞磨口錐形瓶中，各加入30mL苦苣菜黃酮提取液，密封，在25℃恒溫振蕩器中震蕩吸附24h后，測定吸附前后黃酮濃度的變化，按照式（1）和式（2）計(jì)算各樹脂的吸附容量和吸附率。測定完畢，用80%乙醇溶液進(jìn)行洗脫，測定解吸附液中黃酮類物質(zhì)的濃度，按式（3）計(jì)算解吸附率，確定具有良好純化性能的樹脂。

式中：

CA—— 吸附容量，mg／g；

R1—— 吸附率，%；

R2—— 解吸率，%；

C0—— 起始濃度，mg／mL；

C1—— 平衡濃度，mg／mL；

C2—— 解吸液濃度，mg／mL；

V—— 吸附液體積，mL；

m——樹脂干質(zhì)量，g。

1.3 吸附與解吸附條件的優(yōu)化

用去離子水浸泡樹脂AB－8，使其充分溶脹，并抽真空1h。采用濕法裝柱，將苦苣菜提取液注入樹脂柱中，待樣品溶液全部通過樹脂柱后，用去離子水沖洗至流出液無色，以一定濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，收集乙醇洗脫液，經(jīng)真空干燥后，在510nm處測定黃酮濃度。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室在吸附與解吸附過程中所確定的單因素試驗(yàn)結(jié)果，最終，在吸附過程中選取上樣液濃度、上樣液速率、上樣液pH值3個(gè)因素（見表1）；在解吸附過程中，選取乙醇洗脫濃度、解吸流速及乙醇洗脫體積3個(gè)因素（見表2），依據(jù) Design－Expert 7.0軟件采用Box－Behnken Design方法確定其最優(yōu)工藝。

表2 大孔樹脂解吸附效果響應(yīng)曲面因素與水平表Table 2 Factors and levels of RSM

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的靜態(tài)平衡吸附和解吸特性

由表3可知，在8種樹脂中，AB－8樹脂的單位吸附容量值為最高，達(dá)到了23.13mg／g，其吸附率和解吸率也為最高，分別達(dá)到了74.85%和82.36%，與其他8種樹脂相比，樹脂AB－8最適宜分離純化苦苣菜黃酮，因此選用其來分離苦苣菜黃酮。

表3 不同樹脂對苦苣菜黃酮吸附容量、吸附率及解吸率Table 3 Construction Parameter of Resins，Adsorption and Desorption Properties on Flavonoids

2.2 苦苣菜黃酮分離純化工藝的優(yōu)化

在吸附過程中，上樣液pH值、上樣液濃度、上樣液流速等因素都會影響大孔樹脂對黃酮的吸附效果。在解吸附過程中，乙醇洗脫濃度，乙醇洗脫體積以及解吸流速對解吸附過程會產(chǎn)生不同的影響。根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合本實(shí)驗(yàn)室單因素試驗(yàn)，分別采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法來優(yōu)化苦苣菜黃酮的吸附和解吸附過程，結(jié)果見表4、表5。

表4 吸附試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experiment design and result of response surface method analysis

表5 解吸附試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experiment design and result of response surface method analysis

在吸附過程中，由二次曲面模型擬合得回歸方程：

式（4）P值為0.000 8＜0.01，可判別響應(yīng)值與全體自變量變化關(guān)系為顯著相關(guān)，其R2為0.951 5，說明響應(yīng)值中有95.15%來源于模型中全體自變量，其中，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)對響應(yīng)值有顯著性影響，且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明該回歸模型與實(shí)測值能較好地?cái)M合，具有較強(qiáng)可靠性。剔除式（4）中不顯著的回歸系數(shù)，簡化后的回歸方程：

在解吸附過程中，由二次曲面模型擬合得回歸方程：

式（6）P值為0.000 7＜0.01，其響應(yīng)值與全體自變量為顯著相關(guān)，其R2為0.954 2，說明響應(yīng)值中有95.42%來源于模型全體自變量，其中，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)對響應(yīng)值有顯著性影響，且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明該回歸模型與實(shí)測值能較好地?cái)M合，具有較強(qiáng)可靠性。剔除式（6）中不顯著的回歸系數(shù)，簡化后的回歸方程：

2.2.1 主效應(yīng)分析 由表6可知，由于式（4）中各因素均經(jīng)無量綱線性編碼處理，且所有回歸系數(shù)之間都是不相關(guān)的，因此，可以由回歸系數(shù)絕對值的大小來直接比較各因素一次項(xiàng)對苦蕎黃酮得率的影響［14］。式（4）中A項(xiàng)和B項(xiàng)，即上樣液濃度和上樣液速率對吸附率影響最大，各項(xiàng)對響應(yīng)值的影響大小排序?yàn)樯蠘右簼舛龋旧蠘右核俾剩旧蠘右簆H。

由表7可知，C項(xiàng)和A項(xiàng)，即乙醇洗脫體積和乙醇洗脫濃度對響應(yīng)值影響最大，各項(xiàng)對響應(yīng)值影響作用為乙醇洗脫體積＞乙醇洗脫濃度＞解吸流速。

2.2.2 兩因素間的交互效應(yīng)分析 分別固定原始回歸方程（4）、（6）中任意兩個(gè)因素在零水平，可以得到另外兩個(gè)因素的雙因素模型。由表6可知，其A項(xiàng)（上樣液濃度）和C項(xiàng)（上樣液pH）的交互效應(yīng)對模型影響最大，故應(yīng)重點(diǎn)考察，根據(jù)模型作出的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖1。由表7可知，所有交互項(xiàng)的P值均不顯著，這說明交互項(xiàng)對于模型的影響較小，可此不做討論。

由圖1可知，上樣液pH與上樣液濃度之間的相互影響較顯著，其最優(yōu)點(diǎn)非常接近上樣液濃度3.00%、上樣液pH 5.00，吸附率在其附近達(dá)到最大值。

2.2.3 最優(yōu)提取工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 使用Design Expert 7.0軟件得到最優(yōu)提取工藝的吸附率理論最大值為86.20%；工藝條件為上樣液濃度3.73%，上樣液速率3.6mL／min，pH 5.18。解吸附理論最大值為93.22%；工藝條件為乙醇洗脫濃度78.20%，解吸流速2.88mL／min，乙醇洗脫體積120mL。為檢驗(yàn)RSM分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行黃酮的分離純化試驗(yàn)，實(shí)際測得的吸附率為84.32%，洗脫率為91.73%，與理論預(yù)測值相比相對誤差低于5%。

表6 吸附參數(shù)數(shù)學(xué)回歸模型分析及各項(xiàng)作用顯著性檢驗(yàn) Table 6 Variance analysis of regression equation

表7 解吸附參數(shù)數(shù)學(xué)回歸模型分析及各項(xiàng)作用顯著性檢驗(yàn) Table 7 Variance analysis of regression equation

圖1 上樣液濃度與上樣液pH相互作用示意圖Figure 1 Interaction of the largest volume and pH value

3 結(jié)論

通過比較不同型號大孔吸附樹脂對苦苣菜黃酮的吸附解吸特性，可以看出，AB－8大孔吸附樹脂是一種性能良好的吸附劑，其對黃酮的單位吸附容量值達(dá)到了23.13mg／g，其吸附率和解吸率分別達(dá)到了74.85%和82.36%，將響應(yīng)面分析（RSM）應(yīng)用于純化苦苣菜黃酮工藝，采用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)對純化工藝進(jìn)行研究。依據(jù)BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理求得最佳純化工藝條件，即吸附最佳條件為上樣液濃度3.73%，上樣液速率3.6mL／min，上樣液pH 5.18；解吸附最佳工藝條件為乙醇洗脫濃度78.20%，解吸流速2.88mL／min，乙醇洗脫體積120mL。

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Study on separation and purification ofSonchus oleraceus Ltotal flavonoids by AB－8 macroporous resin with response surface analysis

AN ZhuoJIA Chang－xi

（College of Food Scienc，Beijing Agricultural University，Beijing102206，China）

To study the purification conditions with macroporous resin inSonchusculture.Using the static adsorption method for screening optimum macroporous resin to be purification ofSonchus oleraceusflavones，using dynamic adsorption method to study optimum macroporous resin conditions of purification ofSonchus oleraceusflavonoid.Results the macroporous resin adsorption of AB－8onSonchus flavonewas the best，the best purification conditions were：3.73%sample concentration，sample liquid rate of 3.6mL／min，sample liquid pH was 5.18；by 78.20%ethanol solution，with 120mL（column volume）2.88mL／min rate elution.Using macroporous adsorption resin AB－8，under the optimum conditions，the adsorption rate is up to 84.32%；desorption rate 91.73%.

macroporous resin；static adsorption；dynamic adsorption；celery；flavone

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.034

北京市農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目（編號：PXM2009＿014207078172）

安卓（1986－），男，碩士。E－mail：anzhuo1986＠yahoo.cn

賈昌喜

2012－02－11