王文研，張光亞

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

ELPs－PDOR融合基因表達條件的優(yōu)化

王文研，張光亞

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

利用均勻設(shè)計法和二次多項式逐步回歸，對重組大腸桿菌生產(chǎn)類彈性蛋白多肽－1，3－丙二醇氧化還原酶（ELPs－PDOR）重組蛋白的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化 .結(jié)果表明：在裝液量為30%，誘導(dǎo)劑濃度為6.3mmol·L－1，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時間為2h的優(yōu)化條件下進行培養(yǎng)，重組菌融合蛋白表達量是原始表達量的3.3倍，酶活力提高到10.84mkat·L－1，提高2.1倍.

類彈性蛋白多肽；1，3－丙二醇氧化還原酶；大腸桿菌；重組蛋白；均勻設(shè)計

類彈性蛋白多肽（ELPs）是由五肽重復(fù)序列單元構(gòu)成，其中第4位為除Pro以外的任一氨基酸［1］.ELPs具有依賴于自身的序列、鹽度、溫度敏感的可逆相變過程［2］，并利用可逆相變過程純化重組蛋白的純化方法是一種新型、發(fā)展?jié)摿Υ蟆?yīng)用前景廣泛的非色譜純化技術(shù)，具有操作簡單、回收率高、可對目標蛋白進行濃縮富集等優(yōu)勢，可作為新純化方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的色譜等傳統(tǒng)的蛋白純化方法［3］.1，3－丙二醇氧化還原酶（PDOR，EC 1.1.1.202）是生產(chǎn)1，3－丙二醇（1，3－PD）的關(guān)鍵酶之一 ，具有廣闊的應(yīng)用前景，但目前仍未實現(xiàn)商品化.3－羥基丙醛（3－HPA）是甘油代謝中的一種中間產(chǎn)物 .由甘油經(jīng)脫水酶作用后形成高濃度的3－羥基丙醛對菌體自身有很大的傷害.快速把產(chǎn)生的3－羥基丙醛轉(zhuǎn)化為1，3－丙二醇是提高1，3－丙二醇產(chǎn)量和避免3－羥基丙醛大量積累的有效手段，與該轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的就是PDOR，因此PDOR的產(chǎn)出與純化至關(guān)重要.ELPs標簽的純化方法為純化重組蛋白提供了新方法［4］.但由于ELPs自身結(jié)構(gòu)的特點，其具備高度重復(fù)的序列，在基因表達過程中頻繁使用某些特定的密碼子而導(dǎo)致密碼子疲勞，從而使得基因表達效率較低 .當連接到待分離的重組蛋白后，其基因序列進一步增長，轉(zhuǎn)化到表達載體中表達往往效率不高，成為生產(chǎn)酶制劑的重要制約因素.本文利用均勻設(shè)計方法，對導(dǎo)入到大腸桿菌中ELPs－PDOR的基因表達條件進行優(yōu)化，找出其最適的培養(yǎng)條件.

1 材料與方法

1.1 菌種

表達宿主菌Escherichia coli BLR （DE3），本實驗室保存；質(zhì)粒pUC19－ELPs－dhaT，pET22b（＋）－ELPs－dhaT，由本實驗室構(gòu)建合成［5］.

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1）TB培養(yǎng)基.蛋白胨12.0g·L－1，酵母提取物24.0g·L－1，NH4Cl 3g·L－1，甘油4.5mL·L－1，KH2PO41.7mmol·L－1，K2HPO47.2mmol·L－1，pH＝7.0.

2）LB培養(yǎng)基.蛋白胨10.0g·L－1，酵母浸膏5.0g·L－1，NaCl 10g·L－1，pH＝7.0.

1.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

將含有pET－22b－ELPs－dhaT重組質(zhì)粒的BLR（DE3）工程菌按1%的接種量接種到的5mL含100μmol·L－1氨芐青霉素的LB種子培養(yǎng)基中，于37℃，200r·min－1下過夜培養(yǎng)；然后，按1∶100的量將種子菌接種到含100μmol·L－1氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基，于35℃，200r·min－1下培養(yǎng)至D（600）為0.8時，加入IPTG誘導(dǎo)劑，低溫誘導(dǎo).將發(fā)酵培養(yǎng)液于4℃，4 000r·min－1條件下離心15min，收獲菌體；然后用預(yù)冷的磷酸鹽（PBS）緩沖液（137mmol·L－1NaCl，2.7mmol·L－1KCl，4.2mmol·L－1NaH2PO4，1.4mmol·L－1KH2PO4，pH＝7.3）重懸菌體，置冰浴中；最后用300W 超聲破碎菌體4 min，其上清為無細胞抽提液 .通過測定可得到酶活力的變化.

1.4 PDOR 酶活力測定［6－7］

在含30mmol·L－1硫酸銨，1μmol·L－1的硫酸亞鐵銨，0.1mol·L－1的1，3－PD，2.0mmol·L－1的 NAD＋和0.1mol·L－1的碳酸鉀緩沖液（pH＝9.5）的1.5mL酶反應(yīng)體系中，在45℃，340nm下連續(xù)測定并跟蹤酶反應(yīng)過程中的吸光值變化；然后，通過酶活計算式可得到PDOR的酶活（z）.對于PDOR還原3－HPA為1，3－PD的正反應(yīng)而言，一個酶活單位（kat）定義為1s內(nèi)催化1mol底物3－HPA所需要的酶量.

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)化條件的選擇

重組目的蛋白ELPs－PDOR在大腸桿菌中的表達受眾多因素的影響，如接種量、培養(yǎng)溫度、溶氧量、誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間等.其中，氧是影響大腸桿菌生長和代謝的重要因素之一，大腸桿菌只能利用溶解在培養(yǎng)基中的氧氣生長.當培養(yǎng)基中氧氣不足時，大腸桿菌的呼吸鏈和三羧酸循環(huán)（TCA）就會被抑制，轉(zhuǎn)而通過糖酵解途徑來獲取能量，同時大量積累乙酸；而乙酸的積累會抑制菌體的生長以及目的重組蛋白的合成.溫度是影響重組菌生長和產(chǎn)物合成的又一重要因素，重組菌的生長速度和溫度密切相關(guān)，隨著溫度的降低，重組菌的代謝速度明顯下降，對氧和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗明顯下降.

IPTG作為誘導(dǎo)劑，對于大腸桿菌的生長密度及代謝速度有明顯的影響［8］，加入IPTG后，菌體生長速度降低，降低生長壓力，同時增加表達重要蛋白產(chǎn)物的速度.誘導(dǎo)溫度對基因的調(diào)控機制影響很復(fù)雜，涉及DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及低分子量調(diào)節(jié)分子合成等方面，以及菌體生長密度、代謝物的產(chǎn)生是不可或缺的考察因素，ELPs重組蛋白在大腸桿菌中表達已有文獻報道，其誘導(dǎo)溫度多在25℃.

基于上述原因，選取對重組蛋白蛋白表達產(chǎn)物有重要影響的4個因素：誘導(dǎo)劑濃度（異丙基－β－D－硫代半乳糖苷，IPTG）（X1）、誘導(dǎo)溫度（X2）、誘導(dǎo)時間（X3）和裝液量（X4）為自變量，以PDOR酶活力為因變量Y，采用U（144）不等水平均勻設(shè)計表設(shè)計實驗［9］，對重組菌產(chǎn)生重組蛋白酶的進行優(yōu)化.

2.2 培養(yǎng)最優(yōu)條件確定

考察培養(yǎng)基成分對ELPs－PDOR蛋白酶活力的影響，其均勻設(shè)計方案及實驗結(jié)果如表1所示.通過二次多項式逐步回歸分析，以調(diào)整相關(guān)數(shù)R最大為原則，對該模型進行顯著性檢驗，建立回歸方程為

其中：相關(guān)系數(shù)R為0.996，F(xiàn)值為186.958，顯著性水平小于0.001，回歸極顯著，表明該方程能很好地擬合各考察參數(shù)對于目標蛋白酶活力的影響過程.

通過規(guī)劃求解，目標蛋白酶活力Y 的最大值為11.40mkat·L－1，此時各因素值：X1＝6.3，X2＝30，X3＝2，X4＝0.3.表明，當誘導(dǎo)劑量為6.3mmol·L－1，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時間為2h，裝液量為30%時，目標蛋白酶活力理論酶活力可達11.40mkat·L－1.

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化均勻設(shè)計表Tab.1 Uniform design table of cultivation parameters optimization

續(xù)表Continue table

2.3 培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶量的影響

由表1可知：第8組實驗組得到酶活力為10.27mkat·L－1，是14組中產(chǎn)酶量最高的一組；第4組實驗得到的酶活力為9.16mkat·L－1，僅次于第8組 .這兩組培養(yǎng)條件的誘導(dǎo)溫度（X2）均為各水平中最大值30℃，在此溫度下的培養(yǎng)中，菌體生長，代謝處于活躍狀態(tài)，對于目標蛋白的產(chǎn)生具有優(yōu)勢.初步得到X2對產(chǎn)酶量有較大影響.另由回歸方程得到X22系數(shù)的t值為26.21，此因素對Y值影響最大，故誘導(dǎo)溫度對于E.coli產(chǎn)生重組蛋白影響顯著.第10組實驗組得到的酶活力僅為4.69mkat·L－1，由于其培養(yǎng)時誘導(dǎo)溫度為18℃，溫度較低，菌體生長受抑制，表達蛋白的速度減緩，因此造成酶活力較低.同時，此實驗組的培養(yǎng)基裝液量為90%，菌體培養(yǎng)時，由于溶氧量缺乏，使得菌體代謝速度緩慢.上述兩種因素是造成第10組實驗組產(chǎn)生目標蛋白的基因表達效率降低，PDOR酶活力較低的主要原因.

誘導(dǎo)劑量也是影響重組菌產(chǎn)生目標蛋白的關(guān)鍵因素，加入IPTG誘導(dǎo)劑后，隨著誘導(dǎo)時間的增加，產(chǎn)生蛋白酶活力有所下降.這主要是由于IPTG對菌體有一定毒性，甚至過量表達的蛋白也會使細胞致死；同時，長時間存在且不能被分解的IPTG會引起酶活力和穩(wěn)定性的下降及酶蛋白的分解［10］.由于優(yōu)化后菌株表達了更大量的外源蛋白，因此菌體受到的毒性更大，酶活力也就受到了更大的影響.因此，誘導(dǎo)劑劑量及誘導(dǎo)時間也是對酶活力影響的重要因素.經(jīng)過均勻設(shè)計得到的最佳誘導(dǎo)劑量為6.3 mmol，且誘導(dǎo)時間為2h，相較于傳統(tǒng)的原始的培養(yǎng)條件（誘導(dǎo)劑量為1.0mmol，誘導(dǎo)時間為10h），增加了誘導(dǎo)劑量，減少了誘導(dǎo)時間，對目標蛋白的酶活力抑制降低.

2.4 優(yōu)化條件的驗證

通過上述均勻設(shè)計實驗和二次多項式逐步回歸，得到重組菌發(fā)酵產(chǎn)生目標蛋白最優(yōu)培養(yǎng)條件，以及在此優(yōu)化條件下ELPs－PDOR酶活力預(yù)測值為11.40mkat·L－1.在原始培養(yǎng)條件（誘導(dǎo)劑量為1.0 mmol·L－1，誘導(dǎo)溫度為18℃，誘導(dǎo)時間為10h，裝液量為60%）培養(yǎng)得到的ELPs－PDOR重組蛋白，其酶活力為5.15mkat·L－1；而在優(yōu)化條件下，ELPs－PDOR的酶活力達到10.84mkat·L－1，與預(yù)測值的相對誤差僅為5%.相較于優(yōu)化前培養(yǎng)條件，優(yōu)化后目標蛋白酶活力提高了110.21%.

大腸桿菌優(yōu)化后，對其培養(yǎng)液的無細胞抽提液進行SDS－PAGE分析，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知：優(yōu)化培養(yǎng)條件前的ELPs－PDOR蛋白表達量為7.4%，而優(yōu)化后的ELPs－PDOR蛋白表達量增加為24.1%，表達量是優(yōu)化前的3.3倍，優(yōu)化的培養(yǎng)條件對產(chǎn)生重組的ELPs－PDOR有明顯的促進作用.驗證實驗表明：在優(yōu)化條件下，培養(yǎng)的重組菌對于序列較長，含高度重復(fù)序列的重組基因的表達，以及對其酶活力性能等方面有顯著的提高.

圖1 優(yōu)化前后大腸桿菌表達ELPs－PDOR的SDS－PAGE分析Fig.1 SDS－PAGE analysis of ELPs－PDOR before and after optimization

3 結(jié)束語

利用均勻設(shè)計實驗和二次多項式逐步回歸的方法，優(yōu)化了菌種發(fā)酵產(chǎn)ELPs－PDOR重組蛋白培養(yǎng)條件：誘導(dǎo)劑為6.3mmol·L－1，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)時間為2h，裝液量為30%.此條件得到的酶活力可達到1.84mkat·L－1，為優(yōu)化前的2.1倍，且ELPs－PDOR產(chǎn)量明顯優(yōu)于原始培養(yǎng)條件產(chǎn)生的重組蛋白量，具有較大的優(yōu)勢.

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Optimization of Cultivation Conditions of ELPs－PDOR Fusion Gene

WANG Wen－yan，ZHANG Guang－ya

（College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

The optimal parameters of cultivation condition of eastin－like polypeptides－1，3－propanediol oxidoreductase（ELPs－PDOR）by recombinant Escherichia coli were obtained through uniform－design and two polynomial stepwise regression.The optimal conditions of experiment were as follows：the medium volume was 30%，the induction concentration was 6.3mmol·L－1，the cultural temperature was 30℃and the induction temperature was 2h.On the basis of this，the yield of ELPs－PDOR is 3.3times higher than the primitive expression，and the enzymatic activity of PDOR is 10.84mkat·L－1which is 2.1times of the enzymatic activity of primitive expression.

eastin－like polypeptides；1，3－propanediol oxidoreductase；Escherichia coli；recombinant protein；uniformdesign

TQ 923；Q 554

A

1000－5013（2012）03－0296－04

2011－11－22

張光亞（1975－），男，教授，主要從事酶學(xué)與酶工程的研究.E－mail：zhgyghh＠hqu.edu.cn.

國家自然科學(xué)基金資助項目（20806031）；福建省自然科學(xué)基金資助項目（2009J01030）；福建省高校新世紀優(yōu)秀人才支持項目（07176C02）

（責任編輯：錢筠 英文審校：劉源崗）