曹曉燕,王政軍,王喆之
(陜西師范大學(xué)藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室西北瀕危藥材資源開發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710062)
秦艽是傳統(tǒng)的常用中藥材,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,其主要原植物為龍膽屬(Gentiana L.)種類秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)、麻花秦艽(G.straminea Maxim.)、粗莖秦艽(G.crassicaulis Duthie ex Burk.)或小秦艽(G.dahurica Fisch.),主要藥用部位為干燥根。秦艽具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛和退虛熱的功效,可治療風(fēng)濕痹痛、中風(fēng)半身不遂、筋脈拘攣、骨節(jié)酸痛、濕熱黃疸、骨蒸潮熱及小兒疳積發(fā)熱等[1]。秦艽根中含有以龍膽苦苷為主的多種環(huán)烯醚萜苷類化合物,是秦艽的主要藥用有效成分。其中,龍膽苦苷具有保肝、抑菌、抗炎和抗病毒等多方面作用[2];馬錢苷酸具有一定的抗炎作用[3];獐牙菜苦苷具有提高皮膚機(jī)能、促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、抑制中樞神經(jīng)、鎮(zhèn)痛抗炎等作用[4];獐牙菜苷則具有抗肝細(xì)胞損傷的作用[5]。
隨著秦艽的深入研究與開發(fā),其需求量日益增加,但野生資源已遭到嚴(yán)重破壞,早在1987年就被列為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種[6]。由于秦艽的藥用部位是根部,其地上部分往往棄之不用,造成大量資源的浪費(fèi),因此,對(duì)秦艽地上部分的藥用成分和藥用價(jià)值的研究對(duì)于秦艽資源的充分利用具有重要意義。迄今為止,關(guān)于秦艽地上部分活性成分的研究報(bào)道相對(duì)較少[7],尤其是對(duì)秦艽不同器官中環(huán)烯醚萜苷含量的比較研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
作者在前期研究的基礎(chǔ)上[8-9],采用HPLC法對(duì)秦艽、麻花秦艽、粗莖秦艽和小秦艽的根、莖、葉及花中4種環(huán)烯醚萜苷(馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷)含量進(jìn)行了測(cè)定和比較分析,以期為秦艽資源特別是地上部分的深度開發(fā)利用提供基礎(chǔ)研究資料。
供試的秦艽、麻花秦艽、粗莖秦艽和小秦艽的采集地及生長(zhǎng)類型見(jiàn)表1。原植物經(jīng)陜西師范大學(xué)植物學(xué)教研室鑒定。在每一產(chǎn)地隨機(jī)采集植物的全株,分成根、莖、葉和花4個(gè)部分,自然陰干、粉碎后過(guò)80目篩,備用。
表1 供試4種秦艽屬植物的基本信息Table1 Basic information of four species of Gentiana L.tested
儀器和試劑:日本島津SHIMADZU LC-2010高效液相色譜儀(包括自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器和LC solution色譜工作站等)、MILLI-QS超純水儀(美國(guó)MILLIPORE公司)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)和KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);甲醇為色譜純級(jí),磷酸為分析純級(jí)(天津市化學(xué)試劑三廠),超純水;龍膽苦苷(批號(hào)110770-200611)和獐牙菜苦苷(批號(hào)0785-200203)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,馬錢苷酸(批號(hào)020230S)和獐牙菜苷(批號(hào)C16H2209)對(duì)照品均購(gòu)自北京中西化玻有限公司,純度均大于99.5%。
1.2.1 對(duì)照品溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密稱取龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷對(duì)照品適量,用甲醇分別配成質(zhì)量濃度1.0、0.3、0.3和0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液,經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾,濾液用于HPLC分析。
參照文獻(xiàn)[9]的色譜條件進(jìn)行HPLC分析。分別精密吸取馬錢苷酸對(duì)照品溶液0.5、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0μL,獐牙菜苦苷對(duì)照品溶液0.5、1.0、3.0、9.0和27.0μL,龍膽苦苷對(duì)照品溶液0.5、2.0、8.0、16.0、32.0和64.0μL,獐牙菜苷對(duì)照品溶液0.1、0.5、2.0、8.0、32.0和64.0μL,依次進(jìn)樣分析。
以峰面積為縱坐標(biāo)y、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。馬錢苷酸對(duì)照品的線性回歸方程為y=1.468×106x+5.526×104(r=0.9993),線性范圍為0.15~9.60μg;獐牙菜苦苷對(duì)照品的線性回歸方程為y=5.343×105x+3.851×103(r=0.9999),線性范圍為0.15~8.10μg;龍膽苦苷對(duì)照品的線性回歸方程為y=1.231×106x+1.786×105(r=0.9997),線性范圍為0.50~64.00μg;獐牙菜苷對(duì)照品的線性回歸方程為y=1.794×106x-3.698×104(r=0.9996),線性范圍為0.01~6.40μg。
1.2.2 供試樣品溶液制備及HPLC分析 參照文獻(xiàn)[9]的方法和條件制備供試樣品溶液并進(jìn)行HPLC分析,進(jìn)樣量為2μL。依據(jù)各對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量。
1.2.3 方法學(xué)考察
1.2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取龍膽苦苷對(duì)照品溶液,按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析,連續(xù)進(jìn)樣5次。峰面積的RSD值為0.8%,表明儀器的精密度良好。
1.2.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取粗莖秦艽根部樣品粉末,按上述方法制備供試樣液;分別于0、4、8、16、24和48 h吸取供試樣液2μL,按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析。樣液中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷峰面積的RSD值分別為1.3%、0.9%、1.7%和2.2%,表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。
1.2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取粗莖秦艽根部樣品粉末5份,按上述方法制備供試樣品溶液,并按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析,進(jìn)樣量2μL。樣品溶液中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的平均值分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.84%、0.76%、10.03%和0.04%,RSD值分別為1.1%、2.9%、2.1%和1.8%,表明該方法重復(fù)性好。
1.2.3.4 加樣回收率測(cè)定 精密稱取各成分含量已知的粗莖秦艽根部樣品粉末5份,每份0.25 g,分別準(zhǔn)確加入龍膽苦苷對(duì)照品25 mg、馬錢苷酸對(duì)照品溶液3 mL、獐牙菜苦苷對(duì)照品溶液3 mL和獐牙菜苷對(duì)照品溶液0.5 mL,按照上述方法制備供試樣品溶液;吸取供試樣品溶液2μL,按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析,計(jì)算加樣回收率。供試樣品溶液中馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的加樣回收率分別為98.7%、99.1%、102.0%和97.5%,RSD值分別為1.0%、1.9%、2.2%和2.1%。
供試的4種秦艽屬種類不同器官中4種環(huán)烯醚萜苷成分含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。
2.1.1 龍膽苦苷和馬錢苷酸總量的差異 由表2可見(jiàn):供試4種秦艽屬植物不同器官中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量差異較大,其中,根中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.996%~10.869%,莖中為0.310%~4.065%,葉中為0.235%~4.138%,花中為0.545%~5.591%。小秦艽各器官中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量均最低,粗莖秦艽各器官中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量均最高。
在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中,要求中藥材秦艽中龍膽苦苷和馬錢苷酸的總量不得少于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%[1],以此為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行分析,可見(jiàn):供試的4種秦艽屬植物的藥用部位(即根部)中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量均大于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%,其中,秦艽和粗莖秦艽根中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量均明顯高于小秦艽和麻花秦艽。值得注意的是:秦艽和粗莖秦艽的莖、葉和花3個(gè)地上部位中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量也均高于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%,其中,粗莖秦艽花中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量達(dá)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.591%,甚至與小秦艽根中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量相近;在麻花秦艽和小秦艽莖、葉和花中,除了麻花秦艽花中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.741%)高于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%這一標(biāo)準(zhǔn)外,其他部位龍膽苦苷和馬錢苷酸總量都很低,質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.235%~1.321%。
表2 4種秦艽屬植物不同器官中4種環(huán)烯醚萜苷成分的含量1)Table2 Contents of four iridoid glucosides in different organs of four species of Gentiana L.1)
2.1.2 獐牙菜苦苷和獐牙菜苷含量的差異 由表2可見(jiàn):4種秦艽屬植物不同器官中獐牙菜苦苷和獐牙菜苷含量也有一定差異,根中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.516%~0.953%和0.042%~0.210%,莖中分別為0.173%~0.383%和0.031%~1.700%,葉中分別為0.068%~0.684%和0.020%~3.208%,花中分別為0.460%~0.832%和0.138%~3.827%;其中,獐牙菜苷含量的差異幅度明顯大于獐牙菜苦苷。值得注意的是:小秦艽的莖、葉和花中獐牙菜苷含量均最高,而秦艽的莖和葉及粗莖秦艽的花中獐牙菜苷含量均最低,前者分別為后者的54.8、160.4和27.7倍。
由表2還可知:在同種植物的不同器官中4種環(huán)烯醚萜苷的含量也有明顯差異。4種秦艽屬植物根部的龍膽苦苷含量均明顯高于莖、葉和花,且在莖、葉和花3個(gè)地上部位的含量分布沒(méi)有一致的規(guī)律性。4種秦艽屬植物根部馬錢苷酸的含量也高于莖、葉和花,其中,粗莖秦艽和麻花秦艽根中的馬錢苷酸含量分別是其葉中的13.7和27.9倍,差異最大;而小秦艽根和花中馬錢苷酸含量差異最小,前者僅為后者的1.2倍。獐牙菜苦苷在根和花中的積累較多,而獐牙菜苷在花中的含量均相對(duì)最高。值得注意的是:小秦艽莖、葉和花中獐牙菜苷的含量均明顯高于其根部,分別為根部的11.4、21.5和25.7倍。
從4種環(huán)烯醚萜苷成分的含量來(lái)看:除了小秦艽的地上部位外,不同器官中含量最高的均為龍膽苦苷,且這4種環(huán)烯醚萜苷成分在4種植物根部的分布具有一定的規(guī)律,基本表現(xiàn)為:龍膽苦苷的含量最高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.605% ~10.033%);馬錢苷酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.391%~0.836%)或獐牙菜苦苷的含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.516% ~0.953%)居中;獐牙菜苷的含量最低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.042%~0.210%)。
對(duì)來(lái)源于3個(gè)不同產(chǎn)地的秦艽及2個(gè)不同產(chǎn)地的小秦艽不同器官中4種環(huán)烯醚萜苷成分含量的分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn):來(lái)自3個(gè)不同產(chǎn)地的秦艽樣品中,不同器官中4種環(huán)烯醚萜苷成分含量具有一定的差異;來(lái)源于甘肅馬狹的秦艽根、莖和葉中龍膽苦苷的含量均高于產(chǎn)自陜西太白和甘肅西河鄉(xiāng)的秦艽,而花中龍膽苦苷的含量則以陜西太白產(chǎn)秦艽最高;產(chǎn)自陜西太白的秦艽根、莖和花中的馬錢苷酸含量最高,而葉中馬錢苷酸含量則以甘肅西河鄉(xiāng)產(chǎn)秦艽最高;產(chǎn)自陜西太白的秦艽花中獐牙菜苦苷和獐牙菜苷含量均高于來(lái)源于另2個(gè)產(chǎn)地的秦艽。但4種環(huán)烯醚萜苷成分含量在不同產(chǎn)地秦艽根、莖、葉、花中的分布規(guī)律具有較高一致性,即龍膽苦苷含量最高、獐牙菜苷含量最低。
由表3還可見(jiàn):來(lái)自青?;ブ完兾鼢胗蔚?個(gè)小秦艽樣品不同器官中4種環(huán)烯醚萜苷成分含量也有明顯差異。陜西麟游產(chǎn)小秦艽不同器官中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的含量均略高于青?;ブa(chǎn)小秦艽對(duì)應(yīng)器官;馬錢苷酸含量在不同產(chǎn)地小秦艽根、莖和葉中差異不大,但在花中差異非常大,其中產(chǎn)自青?;ブ男∏剀椿ㄖ旭R錢苷酸含量是來(lái)源于陜西麟游小秦艽花的6.4倍;而產(chǎn)自青海互助的小秦艽莖、葉和花3個(gè)地上部位中獐牙菜苷的含量不但明顯高于產(chǎn)自陜西麟游的小秦艽,在供試的4種秦艽屬植物的7個(gè)樣品中也最高,其莖、葉和花中獐牙菜苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá)2.884%、5.215%和7.321%。
表3 不同產(chǎn)地秦艽和小秦艽不同器官中4種環(huán)烯醚萜苷成分的含量1)Table3 Contents of four iridoid glucosides in different organs of Gentiana macrophylla Pall.and G.dahurica Fisch.from different locations1)
由文獻(xiàn)[8-10]可見(jiàn):馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷在秦艽根中均有分布,其中龍膽苦苷的含量最高,獐牙菜苷的含量最低。本實(shí)驗(yàn)也得到了基本一致的研究結(jié)果,說(shuō)明供試的4種秦艽屬植物根部環(huán)烯醚萜苷成分的次生代謝過(guò)程具有相似性。秦艽和粗莖秦艽根中龍膽苦苷和馬錢苷酸總量高于小秦艽和麻花秦艽,這一結(jié)果與李建民等[11]和汪榮斌等[12]的相關(guān)研究結(jié)果也基本一致。
李建民等[11]對(duì)粗莖秦艽、麻花秦艽、小秦艽不同器官龍膽苦苷含量的測(cè)定結(jié)果顯示:這3種植物地上部分龍膽苦苷含量均較高,質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為3.90%;而本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的小秦艽地上部分龍膽苦苷含量均較低,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.157%~0.219%(表3),測(cè)定結(jié)果差異較大,推測(cè)可能與供試樣品的產(chǎn)地不同有關(guān)。張興旺等[13]對(duì)麻花秦艽不同器官獐牙菜苦苷含量的測(cè)定結(jié)果表明:麻花秦艽根、莖、葉和花中獐牙菜苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.43%、0.15%、0.51%和0.38%;本實(shí)驗(yàn)所測(cè)的麻花秦艽根、莖、葉和花中獐牙菜苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.711%、0.173%、0.068%和0.618%,測(cè)定結(jié)果有一定的差異,尤其是葉中獐牙菜苦苷的含量差異很大。推測(cè)造成這種差異的原因除了與供試樣品的產(chǎn)地不同有關(guān)外,可能還與不同的采收時(shí)間有關(guān)。張興旺等[13]使用的樣品采收時(shí)間為具有果實(shí)的開花晚期,而本研究使用的樣品均采自沒(méi)有果實(shí)的開花中期。但是,本研究測(cè)得的麻花秦艽花中獐牙菜苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.387%,與張興旺等[14]對(duì)青海10個(gè)不同產(chǎn)地麻花秦艽花中獐牙菜苷含量的測(cè)定結(jié)果(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.346%~0.453%)基本一致。
現(xiàn)有的研究資料顯示:在麻花秦艽花中龍膽苦苷含量差異很大。李建民等[11]曾報(bào)道采自青海的野生麻花秦艽花中龍膽苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.88%;張華等[15]測(cè)得來(lái)自青海7個(gè)產(chǎn)區(qū)麻花秦艽花中龍膽苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25% ~0.82%;胡一晨等[16]測(cè)得四川、青海、西藏等不同產(chǎn)地7批麻花秦艽花中龍膽苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.50%~5.84%;而本實(shí)驗(yàn)測(cè)得青海湟源產(chǎn)麻花秦艽花中龍膽苦苷的含量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.318%,說(shuō)明產(chǎn)地對(duì)植物次生代謝成分的積累有很大影響。
在小秦艽地上部分(莖、葉和花)中,獐牙菜苷的平均含量不但高于其根部,也高于其他3種植物,差異極大,特別是產(chǎn)自青海互助的小秦艽地上部分的獐牙菜苷含量最高,分別是其根部的22.9、41.4和58.1倍。獐牙菜苷是龍膽科(Gentianaceae)植物的苦味成分及活性成分之一,具有退熱和抗驚厥的作用[14],因此,若以獐牙菜苷為目的成分,小秦艽地上部分值得進(jìn)一步開發(fā)利用。由此也可見(jiàn):供試的秦艽、粗莖秦艽、麻花秦艽和小秦艽不用器官中4種環(huán)烯醚萜苷成分含量各有不同,因而,從不同的藥用活性成分角度出發(fā),可對(duì)這些植物的不同部位進(jìn)行深度開發(fā)。
致謝:云南麗江玉龍縣新主村的楊杰武師傅和青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院的李永平老師在樣品收集方面給予較大幫助,謹(jǐn)此致謝!
[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:253.
[2]穆禎強(qiáng),于 洋,高 昊,等.龍膽屬秦艽組植物的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志,2009,34(16):2012-2017.
[3]RECIO MC,GINER R M,Má?EZ S,et al.Structural considerations on the iridoids as anti-inflammatory agents[J].Planta Medica,1994,60(3):232-234.
[4]孫文基,繩金房.天然活性成分簡(jiǎn)明手冊(cè)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,1998:539.
[5]胡若琪,饒嫻宜.獐牙菜甙對(duì)D-氨基半乳糖性甙損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床肝膽病雜志,1988,4(3):27.
[6]國(guó)家醫(yī)藥管理局.國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄[EB/OL].1987-10-30[2011-09-20].http:∥cnki.shsmu.edu.cn/yywsgl/ yywsgl1/YPSCJYGL/BMGZ/BMGZ1279.htm.
[7]馬 瀟,朱俊儒,何祿仁,等.甘肅產(chǎn)秦艽不同部位中龍膽苦苷的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2009,15(8):10-11.
[8]曹曉燕,王喆之.云南粗莖秦艽不同采收期4種環(huán)烯醚萜苷類成分的測(cè)定[J].藥物分析雜志,2010,30(4):623-625.
[9]CAO X Y,WANG Z Z.Simultaneous determination of four iridoid and secoiridoid glycosides and comparative analysis of Radix Gentianae Macrophyllae and their related substitutes by HPLC[J].Phytochemical Analysis,2010,21(4):348-354.
[10]孫 菁,徐文華,王延花,等.藏藥達(dá)烏里秦艽中環(huán)烯醚萜苷的HPLC測(cè)定[J].分析試驗(yàn)室,2008,27(12):51-54.
[11]李建民,李福安,李向陽(yáng),等.粗莖秦艽不同部位龍膽苦甙含量的分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2004,16(3):225-227.
[12]汪榮斌,張西玲,劉麗莎.甘肅產(chǎn)秦艽組植物藥材活性成分含量比較[J].中藥材,2009,32(8):1202-1204.
[13]張興旺,于瑞濤,梅麗娟,等.RP-HPLC法測(cè)定秦艽不同器官中獐牙菜苦苷含量的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(20):9476-9477.
[14]張興旺,陳 晨,陶燕鐸,等.青海省不同產(chǎn)地秦艽花中獐牙菜苷和異葒草苷含量的HPLC分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2010,19(2):92-93.
[15]張 華,李福安,李向陽(yáng),等.青海道地藥材秦艽花中龍膽苦苷的含量測(cè)定[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,30(2):130-132.
[16]胡一晨,萬(wàn) 麗,張 藝,等.秦艽花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化研究[J].中藥與臨床,2011,2(2):16-18.