王雷宏，鄭玉紅，湯庚國

〔1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園林學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.江蘇省·中國科學(xué)院植物研究所（南京中山植物園），江蘇 南京 210014；3.南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037〕

山荊子〔Malus baccata（L.）Borkh.〕是蘋果屬（Malus Mill.）脫萼組（Sect.Gymnomeles Koehne）種類中分布范圍最廣的一個(gè)種，集中分布于中國，為東亞分布型，是典型的多型性發(fā)達(dá)種［1］。山荊子生長速度快、易繁殖，與蘋果（M.pumila Mill.）嫁接后親和力強(qiáng)、耐寒性強(qiáng)，是東北、華北和西北山區(qū)蘋果嫁接的主要砧木材料；山荊子花、果美麗，果實(shí)、種子、嫩葉和木材等均具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是蘋果屬的珍貴野生植物資源［2］。有關(guān)該種形態(tài)變異、遺傳多樣性等方面的研究結(jié)果表明：山荊子居群間的遺傳分化和親緣關(guān)系較為復(fù)雜［3-6］。Nei［7］認(rèn)為：物種表型進(jìn)化是由相互作用的基因突變引起的，不同分類等級(jí)物種的表型多樣性是新突變和遺傳基因的累積產(chǎn)物，新突變基因通過自然選擇和基因漂變被納入基因組中并產(chǎn)生遺傳保守性，從而影響表型進(jìn)化的方向；Rouzine等［8］通過對(duì)植物的病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為：低多樣性居群受中性變異控制，高多樣性居群受自然選擇控制，不同物種的遺傳變異差異明顯。因此，探明山荊子的居群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化規(guī)律及地理居群的多樣性是闡明其系統(tǒng)進(jìn)化和演化的主要途徑，對(duì)山荊子的物種起源和遺傳進(jìn)化研究具有重要意義。

作者采用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)山荊子主要分布區(qū)的8個(gè)居群140個(gè)單株的遺傳多樣性、居群遺傳結(jié)構(gòu)以及居群間的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，以期為該種的起源和地理演化規(guī)律研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

選取分布于黑龍江、吉林、河北、山西和北京等地的8個(gè)山荊子居群進(jìn)行取樣，各居群的概況見表1。每個(gè)居群隨機(jī)選取20株以上生長狀況良好的植株作為樣株，總株數(shù)不足20株的居群則全部選為樣株，8個(gè)居群共計(jì)140個(gè)樣株。在樣株上采集健康的幼嫩葉片，用變色硅膠迅速干燥并帶回實(shí)驗(yàn)室，常溫條件下保存、備用。

表1 供試的8個(gè)山荊子居群概況Table1 Status of eight populations of Malus baccata（L.）Borkh.tested

1.2 方法

參照Doyle等［9］的CTAB法提取葉片基因組總DNA。將獲得的DNA溶解于滅菌雙蒸水中，-20℃貯存、備用。根據(jù)文獻(xiàn)［10-12］確定30對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出擴(kuò)增條帶豐富、信號(hào)強(qiáng)的10對(duì)引物用于SSR擴(kuò)增反應(yīng)。引物均由上海英駿生物工程技術(shù)有限公司合成。

采用PE-9700 PCR儀（美國GeneAmp公司）進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)相關(guān)試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。反應(yīng)體系總體積10μL，包含0.4μmol·L-1的d ATP、d GTP、d CTP和d TTP，1× Taq DNA聚合酶緩沖液（含有10 mmol·L-1Tris-HCl、50 mmol·L-1KCl和體積分?jǐn)?shù)0.1％Trion X-100，pH8.4），2.5 mmol·L-1MgCl2，0.5 U Taq DNA聚合酶，20 ng模板DNA，0.4μmol·L-1上下游引物，雙蒸水補(bǔ)足至10μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃～60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)反應(yīng)；最后于72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃冰箱中保存。

用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)10％的聚丙烯酰胺凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，采用50 bp Marker〔購自寶生物工程（大連）有限公司〕進(jìn)行分子量標(biāo)記，電壓240 V，電泳時(shí)間1 h。電泳結(jié)束后用銀染法染色，染色方法為：凝膠先用體積分?jǐn)?shù)10％乙醇和體積分?jǐn)?shù)0.5％冰乙酸混合溶液固定12 min，然后用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.2％ AgNO3水溶液處理12 min；水洗后用含質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.5％NaOH、體積分?jǐn)?shù)0.4％甲醛和質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.02％Na2S2O3的混合液顯色5～10 min，至譜帶清晰為止。染色結(jié)束后，將凝膠用自來水沖洗干凈，用FR-200A凝膠成像系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）觀察電泳結(jié)果并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

人工判讀條帶，并應(yīng)用POPGENE v1.31軟件［13］計(jì)算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)和多態(tài)性條帶百分率；基于等位基因頻率，在假設(shè)遺傳平衡的條件下，計(jì)算居群間的基因分化系數(shù)（G st）和基因流（N m），并用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 SSR擴(kuò)增結(jié)果分析

采用10對(duì)SSR引物對(duì)8個(gè)山荊子地理居群140個(gè)單株的基因組總DNA進(jìn)行SSR擴(kuò)增，引物的序列及擴(kuò)增結(jié)果見表2。10對(duì)引物共擴(kuò)增出91條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出9.1條帶，多態(tài)性條帶百分率達(dá)100.00％。其中，引物CH02b12擴(kuò)增出的條帶最多，達(dá)13條；引物U78949擴(kuò)增出的條帶最少，僅4條。

表2 8個(gè)山荊子居群的SSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果Table2 Amplified results of SSR-PCR of eight populations of Malus baccata（L.）Borkh.

2.2 居群的遺傳多樣性分析

根據(jù)SSR標(biāo)記分析結(jié)果得出的8個(gè)山荊子居群的遺傳參數(shù)見表3。由表3可知：吉林長白山山荊子居群的有效等位基因數(shù)最大，為1.5350；山西中條山山荊子居群的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)最高，分別為0.3092和0.4592；河北塞罕壩居群的有效等位基因數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)最低，分別為1.4379和0.2560；山西管涔山居群的Shannon信息指數(shù)最低，為0.3767。吉林長白山居群和山西中條山居群的多態(tài)性條帶最多，均為78條；山西五臺(tái)山居群的多態(tài)性條帶最少，僅59條。從居群的多態(tài)性條帶百分率來看，山西五臺(tái)山居群最低，為64.84％；吉林長白山居群和山西中條山居群最高，均為85.71％。

由表3還可以看出：供試的8個(gè)山荊子居群間的有效等位基因數(shù)為1.6169，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.3551，Shannon信息指數(shù)為0.5285，多態(tài)性條帶百分率達(dá)100.00％，居群間的各項(xiàng)遺傳多樣性指數(shù)均高于居群內(nèi)。

2.3 居群的聚類分析結(jié)果

基于Nei’s遺傳距離獲得的8個(gè)山荊子居群的UPGMA聚類結(jié)果見圖1。在Nei’s遺傳距離0.1486處，8個(gè)居群被分成3個(gè)大組：第1組包括山西五臺(tái)山居群和北京東靈山居群；第2組包括山西中條山居群、吉林長白山居群、黑龍江小興安嶺居群、山西靈空山居群和山西管涔山居群；第3組僅含河北塞罕壩1個(gè)居群。由圖1可見：發(fā)生明顯地理分化的是山西五臺(tái)山居群、北京東靈山居群、山西管涔山居群和河北塞罕壩居群；山西靈空山居群、黑龍江小興安嶺居群、吉林長白山居群和山西中條山居群可能是山荊子的多樣性核心居群。山西五臺(tái)山居群和北京東靈山居群的地理位置較近，遺傳關(guān)系也最近，而其他居群間的遺傳關(guān)系與地理位置沒有明顯的相關(guān)性。

表3 基于SSR標(biāo)記分析的8個(gè)山荊子居群的遺傳多樣性分析結(jié)果Table3 Analysis results of genetic diversity of eight populations of Malus baccata（L.）Borkh.based on SSR marker analysis

圖1 基于SSR標(biāo)記分析結(jié)果的8個(gè)山荊子居群的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA cluster dendrogram of eight populations of Malus baccata（L.）Borkh.based on SSR marker analysis result

2.4 居群間的基因分化分析

對(duì)8個(gè)山荊子居群進(jìn)行基因分化分析，居群間的基因分化系數(shù)（G st）為0.2233，說明在總的遺傳變異中有22.33％存在于居群間；基因流（N m）為1.7395，說明居群間的基因交換較多。

3 結(jié)論和討論

采用10對(duì)SSR引物對(duì)8個(gè)山荊子居群的基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)其基因位點(diǎn)多態(tài)性可知：山西中條山居群的遺傳多樣性最高，其Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.3092，Shannon信息指數(shù)（I）為0.4592；山西靈空山居群的遺傳多樣性也較高，H為0.3056，I為0.4532。陳曦等［5］根據(jù)山荊子居群的RAPD分析結(jié)果，認(rèn)為山西靈空山居群的遺傳多樣性最高（H=0.3045，I=0.4526）。雖然2種方法的結(jié)果不一致，但從絕對(duì)數(shù)值來看，二者差異不大。本研究結(jié)果表明：與蘋果屬植物的遺傳多樣性［14］相比，山荊子居群間的遺傳多樣性（H=0.3551，I=0.5285）明顯低于蘋果屬野生種（H=0.86，I=2.07）及蘋果砧木（H=0.76，I=1.63），其原因與居群劃分方法的不同有關(guān)；但本研究結(jié)果與蘋果屬其他種類，如新疆野蘋果〔Malus sieversii（Ledeb.）Roem.〕［8］、湖北海棠〔M.hupehensis（Pamp.）Rehd.〕［15］、變?nèi)~海棠〔M.toringoides（Rehd.）Hughes〕［16］和小金海棠（M.xiaojinensis Cheng et Jiang）［17］等種類的遺傳多樣性水平相近。

聚類分析結(jié)果表明：在Nei’s遺傳距離0.1486處，供試的8個(gè)山荊子居群被分成3組，居群間的Nei’s遺傳距離最大值為0.2274，與RAPD標(biāo)記的聚類分析結(jié)果相似（RAPD標(biāo)記的Nei’s遺傳距離最大值為0.2249）［5］。但是，同一地域內(nèi)小居群間基于SSR和RAPD標(biāo)記的遺傳關(guān)系分析結(jié)果并不完全一致，其中山西中條山和管涔山居群以及黑龍江小興安嶺居群的差異較大，推測這些山荊子居群在遺傳上可能具有特定的雜合性和分化方向，也可能與這些居群處于從隨機(jī)進(jìn)化向定向進(jìn)化的過渡狀態(tài)有關(guān)。

基于SSR標(biāo)記的8個(gè)山荊子居群的遺傳組成和基因流大小與其RAPD標(biāo)記［5］和ISSR分析［18］的結(jié)論基本一致，按照Wright［19］的理論，表明山荊子群體相對(duì)穩(wěn)定，不存在遺傳漂變，但分化程度較高。聚類結(jié)果顯示：地理位置相近的居群并沒有聚在一起，如山西五臺(tái)山居群、北京東靈山居群和山西管涔山居群地理位置相近，但僅前二者緊密相聚，山西管涔山居群則與中部的核心居群聚在一起。推測山荊子的遷移擴(kuò)散可能是從核心居群向外擴(kuò)展，由于同區(qū)域內(nèi)小居群間基因流不對(duì)稱或不均等，加之特定地理居群可能受到強(qiáng)有力的外界選擇壓力，產(chǎn)生了遺傳分化。結(jié)合“多樣性中心就是起源中心”的理論推測：山荊子起源于我國的華北和東北地區(qū)，向四周擴(kuò)散后在基因流不對(duì)稱和生境的強(qiáng)有力選擇壓力下形成了現(xiàn)有的多樣性分布格局。

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