柏培磊，孫啟武，蔣繼宏，閆 浩，于少帥，張小平，①

（1.安徽師范大學(xué)重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000；

2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；3.江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221116）

南方紅豆杉〔Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu〕又稱美麗紅豆杉，屬常綠植物，為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物，是紅豆杉屬（Taxus L.）中分布最廣、生長(zhǎng)最快的種類之一［1］。南方紅豆杉主要分布于長(zhǎng)江流域以南各省區(qū)、南嶺山脈山區(qū)以及河南和陜西等省的山地或溪谷［2］，安徽黃山是野生型南方紅豆杉重要的自然分布區(qū)之一。

自Wani等［3］從短葉紅豆杉（T.brevifolia Nutt.）中分離得到抗癌藥物紫杉醇并揭示其化學(xué)結(jié)構(gòu)以來(lái)，近年來(lái)有關(guān)紅豆杉屬植物紫杉醇含量的研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)［4－7］；目前對(duì)南方紅豆杉的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用、繁殖技術(shù)、居群多樣性等方面［8－11］，而關(guān)于紅豆杉化學(xué)成分指紋圖譜的研究報(bào)道較少，僅見(jiàn)少數(shù)學(xué)者關(guān)于東北紅豆杉（T.cuspidata Sieb.et Zucc.）枝葉、南方紅豆杉人工林藥材活性成分及南方紅豆杉三氯甲烷提取物的指紋圖譜［12－14］的研究報(bào)道，但是由于供試樣品都來(lái)自同一省份，不具有代表性，因此無(wú)法針對(duì)南方紅豆杉的化學(xué)成分建立完整、全面的指紋圖譜。

為了全面反映南方紅豆杉的化學(xué)成分，確立較完善的南方紅豆杉質(zhì)量評(píng)價(jià)系統(tǒng)，作者對(duì)來(lái)源于6個(gè)產(chǎn)地的12個(gè)南方紅豆杉枝葉樣品中紫杉醇含量和不同產(chǎn)地指紋圖譜的相似度進(jìn)行了比較，初步建立了野生南方紅豆杉的特征指紋圖譜，并結(jié)合環(huán)境因子討論了導(dǎo)致不同產(chǎn)地南方紅豆杉枝葉中紫杉醇含量差異的因素，以期為南方紅豆杉優(yōu)良種源的選育以及藥材種植基地進(jìn)行質(zhì)量控制提供科學(xué)研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試南方紅豆杉枝葉樣品于2009年10月至11月分別采自陜西周至縣和漢中市、甘肅天水市、安徽胡樂(lè)鎮(zhèn)、聶家山和仙寓山，均為野生植株，由安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張小平教授鑒定；每個(gè)產(chǎn)地隨機(jī)選擇胸徑相近的樣株2株，每株為1個(gè)樣品；因南方紅豆杉中紫杉醇含量與植株性別無(wú)關(guān)［15］，故采樣時(shí)不考慮性別因素。隨機(jī)采集樣株上的枝葉，置于50℃烘箱中干燥24 h后粉碎，過(guò)40目篩，待用。

主要儀器：島津LC20A高效液相色譜儀（日本島津公司）、KQ－500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、FA2004A電子分析天平（上海精天儀器有限公司）、RE52－CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、80－2離心機(jī)（江蘇省榮華儀器制造有限公司）、DFY－250粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）和Milli－Q Academic密理博純水器（美國(guó)MILLIPORE公司）。

所用試劑：乙腈和甲醇（色譜純，購(gòu)自美國(guó)迪馬公司），超純水，其余試劑均為分析純；紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自桂林暉昂生化藥業(yè)有限責(zé)任公司（產(chǎn)品編號(hào)JF20090301，純度99.9％）。

1.2 方法

1.2.1 HPLC 色譜分析條件 采用漢邦C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動(dòng)相為乙腈和水，梯度洗脫，具體操作流程為：0～20 min，V（水）∶V（乙腈）=85∶15～50∶50；20～50 min，V（水）∶V（乙腈）=50∶50～0∶100；50～60 min，V（水）∶V（乙腈）=0∶100。流速0.8 mL·min－1，進(jìn)樣量5μL，洗脫時(shí)間60 min，檢測(cè)波長(zhǎng)227 nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，作為紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品母液。用甲醇將紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品母液分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.2、0.1、0.05、0.025和0.005μg·mL－1的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得的線性回歸方程為Y=12016277.6679X－13201.9028（r=1.0000），表明在質(zhì)量濃度0.005～0.2μg·mL－1內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

1.2.3 供試樣液的制備和測(cè)定 精密稱取2 g樣品粉末，室溫下加20 mL體積分?jǐn)?shù)95％乙醇浸泡24 h后超聲處理2 h；4000 r·min－1離心5 min，上清液過(guò)濾，沉淀分別用體積分?jǐn)?shù)95％乙醇超聲提取2次，每次30 min，均經(jīng)4000 r·min－1離心5 min，上清液過(guò)濾；合并3次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干；然后用V（三氯甲烷）∶V（水）=1∶1混合溶劑10 mL進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取3次，合并三氯甲烷相萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于35℃蒸干；浸膏用甲醇溶解并定容至10 mL，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液即為供試樣液。參照上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量5μL。采用外標(biāo)法計(jì)算紫杉醇含量。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取甘肅天水2號(hào)供試樣液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣量5μL。各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值基本一致，RSD值均小于3％，表明該方法精密度良好，符合指紋圖譜檢測(cè)要求。

1.2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取陜西漢中2號(hào)供試樣液，按上述色譜條件分別在0、2、4、6、8和24 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量5μL。各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值基本一致，RSD值均小于5％，表明供試樣液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 取甘肅天水1號(hào)樣品粉末5份，按上述提取方法制備供試樣液，并按上述色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量5μL。各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值基本一致，RSD值均小于3％，表明該方法的重現(xiàn)性良好，符合指紋圖譜檢測(cè)要求。

1.2.4.4 參照峰的確定 分別取適量紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖的對(duì)照，確定參照峰（s）。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用“中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”軟件對(duì)各樣品的指紋圖譜進(jìn)行比較，并構(gòu)建南方紅豆杉的特征指紋圖譜；以陜西周至1號(hào)樣品指紋圖譜為基準(zhǔn)，采用相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法分別計(jì)算其他樣品指紋圖譜與之的相似度。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同產(chǎn)地南方紅豆杉紫杉醇含量的比較

采用外標(biāo)法計(jì)算12個(gè)南方紅豆杉枝葉樣品的紫杉醇含量，并得出同一產(chǎn)地紫杉醇含量的平均值。結(jié)果表明：來(lái)源于陜西周至的南方紅豆杉枝葉中紫杉醇含量最高，平均為0.0193 mg·g－1；來(lái)源于陜西漢中的南方紅豆杉枝葉樣品中紫杉醇含量也較高，平均為0.0165 mg·g－1；來(lái)源于甘肅天水的樣品中紫杉醇含量居中，平均為0.0115 mg·g－1；來(lái)源于安徽省3個(gè)產(chǎn)地的樣品中紫杉醇含量均較低，采自胡樂(lè)、聶家山以及仙寓山的樣品中紫杉醇的平均含量分別為0.0059、0.0070和0.0025 mg·g－1。

2.2 不同產(chǎn)地南方紅豆杉指紋圖譜中共有峰的標(biāo)定及分析

采用“中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)”軟件對(duì)6個(gè)產(chǎn)地12個(gè)南方紅豆杉枝葉樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析和比較，共確定了12個(gè)共有色譜峰；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖的對(duì)照（圖1），發(fā)現(xiàn)樣品指紋圖譜中保留時(shí)間為32.75 min的色譜峰與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間一致，且分離度良好，因此，選定此峰為南方紅豆杉指紋圖譜的參照峰（s），即編號(hào)為9的共有峰。

圖1 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品與南方紅豆杉枝葉樣品色譜圖的比較Fig.1 Com parison of chromatogram s of taxol standard and sam ple of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu

設(shè)定參照峰的保留時(shí)間和峰面積為1，并據(jù)此計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。分析結(jié)果表明：不同樣品12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于1％，說(shuō)明各共有峰的保留時(shí)間穩(wěn)定，可以確定共有峰的存在；但是，12個(gè)樣品各共有峰相對(duì)峰面積的RSD值均大于40％，說(shuō)明各共有峰的相對(duì)含量差異較大，這一現(xiàn)象可能與樣品的差異有關(guān)。

表1 不同產(chǎn)地南方紅豆杉枝葉樣品指紋圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Table1 Relative retention time of common peaks in fingerprint of samples of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.） Cheng et L.K.Fu from different locations

表2 不同產(chǎn)地南方紅豆杉枝葉樣品指紋圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Table2 Relative peak area of common peaks in fingerprint of sam ples of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu from different locations

2.3 不同產(chǎn)地南方紅豆杉指紋圖譜的相似度分析和特征指紋圖譜的建立

根據(jù)6個(gè)產(chǎn)地12個(gè)南方紅豆杉枝葉樣品的色譜圖建立的南方紅豆杉的特征指紋圖譜見(jiàn)圖2。其中，S1～S12為各樣品的色譜圖，R為根據(jù)12個(gè)樣品的色譜圖分析結(jié)果建立的南方紅豆杉特征指紋圖譜。

圖2 不同產(chǎn)地南方紅豆杉枝葉樣品的指紋圖譜及其特征指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of samples of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu from different locations and its characteristic fingerprint

以陜西周至1號(hào)樣品（S1）的色譜圖為基準(zhǔn)，分別將其他樣品的色譜圖與之比較，得到各樣品的相似度值，詳見(jiàn)表3。結(jié)果表明：除了安徽聶家山2個(gè)樣品的相似度值較低外，其余樣品的相似度均較高，相似度值均大于0.8，說(shuō)明12個(gè)共有峰在各樣品中均能穩(wěn)定出現(xiàn)，吻合度較好。由此可以確定：圖2中的南方紅豆杉枝葉的特征指紋圖譜（R）可用于南方紅豆杉真?zhèn)蔚蔫b別。

表3 不同產(chǎn)地南方紅豆杉枝葉樣品指紋圖譜的相似度分析1）Table3 Sim ilarity analysis of fingerprint of samples of branch and leaf of Taxus chinensis var.mairei（Lemée et Lévl.）Cheng et L.K.Fu from different locations1）

3 討論和結(jié)論

南方紅豆杉枝葉成分復(fù)雜，因而，采用適宜的提取分離及分析方法才能使其指紋圖譜能全面反映南方紅豆杉的化學(xué)成分。為此，作者在前期研究中對(duì)樣品的提取溶劑、洗脫劑及流速進(jìn)行了優(yōu)化。其中，采用體積分?jǐn)?shù)95％的乙醇超聲提取，色譜峰數(shù)量較多、分離度和重現(xiàn)性較好；采用乙腈和水（體積比）梯度洗脫系統(tǒng)可以很好地分離各種成分，能提供豐富的色譜信息，且簡(jiǎn)單易制；而采用0.8 mL·min－1的流速，則各成分峰的分離程度好且峰形好。因此，在本研究中作者均采用了優(yōu)化的提取及色譜分析條件。

王朝暉等［16］的研究結(jié)果表明：南方紅豆杉中紫杉醇含量在6月份達(dá)到最大值，然而6月份容易發(fā)生洪澇，土壤含水量長(zhǎng)期過(guò)多可能在一定程度上抑制根系的呼吸作用，從而影響南方紅豆杉的生長(zhǎng)并間接影響紫杉醇的積累。植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生是植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中適應(yīng)生態(tài)環(huán)境變化的結(jié)果，許多植物在受到病蟲(chóng)害的侵染或環(huán)境脅迫后能夠產(chǎn)生并積累大量的次生代謝產(chǎn)物，以增強(qiáng)自身的免疫力和抵抗力。Paolini等［17］的研究結(jié)果表明：萜類化合物可以吸引傳粉者和食草動(dòng)物，幫助植物進(jìn)行花粉傳播，而且在抗氧化和耐熱性調(diào)節(jié)以及防御微生物和害蟲(chóng)等方面有重要作用。作者的研究結(jié)果表明：不同產(chǎn)地南方紅豆杉枝葉中紫杉醇含量差異較大，推測(cè)這一差異可能與生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。來(lái)源于陜西和甘肅的樣品中紫杉醇含量較高，而來(lái)源于安徽3個(gè)產(chǎn)地的樣品中紫杉醇含量均較低，其原因可能是陜西和甘肅屬于溫帶季風(fēng)氣候，夏季高溫少雨、冬季寒冷干燥；而安徽屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，夏季高溫多雨、冬季溫和少雨。夏季的高溫少雨容易造成土壤干旱，從而引發(fā)水脅迫致使南方紅豆杉體內(nèi)的紫杉醇合成途徑開(kāi)啟以加強(qiáng)其自身的防御能力。

相似度分析結(jié)果表明：除了安徽聶家山的2個(gè)樣品外，其他樣品指紋圖譜的相似度值均大于0.8，說(shuō)明供試12個(gè)樣品的指紋圖譜中主要峰群的整體特征基本一致，但由于各化學(xué)成分相對(duì)峰面積的RSD值都大于40％，差異主要表現(xiàn)在峰高上，并且產(chǎn)地相近的樣品指紋圖譜的相似度并不接近，導(dǎo)致樣品間的指紋圖譜不完全一致，說(shuō)明不同產(chǎn)地的樣品中各成分含量的差異較大。藥用植物的化學(xué)組成受外界環(huán)境（如生長(zhǎng)環(huán)境、土壤性質(zhì)）及遺傳因素等方面的影響［18］，使植物體內(nèi)的成分和含量有所不同，在HPLC色譜圖上則表現(xiàn)為某些峰的差異以及相似保留時(shí)間上峰面積的差異。

通過(guò)本研究獲得的6個(gè)產(chǎn)地野生南方紅豆杉枝葉化學(xué)成分的指紋圖譜與楊水平等［13］的研究結(jié)果差異較大，共有峰數(shù)量明顯減少，指紋圖譜的相似度也有差異。造成這種差異的原因可能是由于本研究中的供試樣品均為野生植株，且來(lái)源于不同產(chǎn)地，生長(zhǎng)環(huán)境差異較大；而后者的研究樣品來(lái)自同一種植基地，氣候和土壤環(huán)境差異不大。由于作者的測(cè)定結(jié)果具有明顯的產(chǎn)地差異，因此，獲得的特征指紋圖譜不但具有一定的代表性，也更能全面反映南方紅豆杉的化學(xué)成分特征，對(duì)南方紅豆杉藥材質(zhì)量控制具有一定的參考價(jià)值。

［1］佘 琨，丁艷濤，孟憲璟，等.紫杉醇在我國(guó)的應(yīng)用近況［J］.腫瘤防治雜志，2001，8（4）：440－443.

［2］WU MB，WU Y L，ZHOU J，et al.Structural characterisation of a water-soluble polysaccharide with high branches from the leaves of Taxus chinensis var.mairei［J］.Food Chemistry，2009，113（4）：1020－1024.

［3］WANIMC，TAYLOR H L，WALL ME，et al.Plant antitumor agents VI：the isolation and structure of taxol，a novel antilekemic and antitumor agent from Taxus brevifolia［J］.Journal of the American Chemical Society，1971，93（9）：2325－2327.

［4］郭曉靜，王俊鵬，宋曉平，等.南方紅豆杉產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離鑒定［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2007，27（9）：1874－1878.

［5］楊逢建，龐海河，祖元?jiǎng)?，?南方紅豆杉生長(zhǎng)發(fā)育及其紫杉醇含量與環(huán)境因子的關(guān)系［J］.植物研究，2010，30（6）：742－746.

［6］王昌偉，彭少麟，李鳴光，等.紅豆杉中紫杉醇及其衍生物含量影響因子研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（5）：1583－1590.

［7］李乃偉，彭 峰，馮 煦，等.不同施肥處理對(duì)曼地亞紅豆杉‘Hicksii’生長(zhǎng)和紫杉醇含量的影響［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2008，17（2）：28－33.

［8］LIC F，HUO CH，ZHANGML，et al.Chemistry of Chinese yew，Taxus chinensis var.mairei［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2008，36（4）：266－282.

［9］趙 丁，秦 葵，曹聰梅，等.南方紅豆杉和東北紅豆杉中的單體化合物對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2007，19（4）：635－638.

［10］韓國(guó)勇.南方紅豆杉嫩枝扦插育苗技術(shù)［J］.林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2006，20（5）：87－88.

［11］李乃偉，賀善安，束曉春，等.基于ISSR標(biāo)記的南方紅豆杉野生種群和遷地保護(hù)種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20（1）：25－30.

［12］杜智敏，陳瑞玲，楊寶峰.東北紅豆杉枝葉HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2005，36（1）：106－108.

［13］楊水平，楊 憲，張 雪，等.南方紅豆杉人工林藥材活性成分指紋圖譜鑒別研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（4）：110－113.

［14］李效賢，熊耀康，余陳歡，等.高效液相色譜指紋圖譜法分析南方紅豆杉藥材的氯仿提取物［J］.色譜，2010，28（11）：1067－1070.

［15］項(xiàng) 偉，阮德春，張宏杰，等.不同產(chǎn)地云南紅豆杉紫杉醇的含量分析［J］.西部林業(yè)科學(xué)，1996，75（2）：74－76.

［16］王朝暉，周日寶，劉湘丹，等.湘產(chǎn)南方紅豆杉中紫杉醇含量動(dòng)態(tài)變化的研究［J］.中南藥學(xué)，2010，8（1）：15－17.

［17］PAOLINI J，BARBONI T，DESJOBERT J M，et al.Chemical composition，intraspecies variation and seasonal variation in essential oils of Calendula arvensis L.［J］. Biochemical Systematics and Ecology，2010，38（5）：865－874.

［18］柯春婷，仝 川，王玉震，等.不同地理種源南方紅豆杉中紫杉醇和10－DAB含量及影響因子［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2009，28（2）：231－236.