田晗，劉敏，楊艷羚，李玉桑，唐和斌 （中南民族大學藥學院，湖北 武漢430074）

丹七明目散提取物對視網(wǎng)膜病變具有潛在的治療作用，其中的三七、黃芪能夠抗氧化，改善微循環(huán)［1－2］。淫羊藿苷（icariin）是從淫羊藿中提取分離的一種黃酮類單體化合物［3］。木犀草素（luteolin）屬于黃酮類植物化學物，主要存在于金銀花、菊花、荊芥、白毛夏枯草等藥物中，以及百里香、芽甘藍、洋白菜、菜花、甜菜、椰菜和胡蘿卜等蔬菜中［4］。因此，建立采用高效液相色譜法來準確測定丹七明目散提取物中淫羊藿苷和木犀草素含量的方法，對于該提取物的質(zhì)量控制和確保其療效具有重要的意義。

1 材料

戴安高效液相色譜儀（配有Ultimate 3000 Pump，Ultimate 3000 Autosampler，Ultimate 3000 Column Compartment，Ultimate 3000 Diode Array Detector）；METTLER TOLEDO分析天平（Made in Switzerland，AB265－S型）。淫羊藿苷對照品（批號110737－200415，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）；木犀草素對照品（批號111520－200504，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）。甲醇、磷酸為分析純；乙腈為色譜純（美國Fisher），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件 色譜柱：YCM－Pack ODS－A C18（250 mm×4．6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0．1%磷酸溶液（B）按照表1的比例進行梯度洗脫；檢測波長：270 nm；流速1．0mL·min－1；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 The procedure of gradient elution

2．2 溶液的制備

2．2．1 對照品溶液制備 精密稱定淫羊藿苷對照品約5 mg和木犀草素對照品約2 mg，分別至25 mL量瓶中，用甲醇溶解，搖勻，定容至25 mL制成對照品母液，并用0．45μm微孔濾膜過濾備用，4℃冰箱保存。

2．2．2 供試品溶液制備 丹七明目散提取物的制備：該提取物包含丹參（安徽，批號120501），三七（云南，批號091101），杭白菊（浙江，批號120401），淫羊藿（甘肅，批號120601），黃 精 （湖 南，批 號 121101），麥 冬 （湖 北，批 號121001）6味藥，其中淫羊藿、丹參、黃精3味中藥采用水提醇沉法，三七、杭白菊、麥冬3味中藥采用70%乙醇提取3次，濃縮合并提取物，干燥備用［2］。然后精密稱取其提取物1．90 g，置于10 mL量瓶中，并用純化水定容至刻度，密塞，超聲處理10 min，放冷，搖勻，用0．45μm微孔濾膜過濾作為供試品溶液，放置于4℃冰箱中存儲，備用。

2．2．3 陰性樣品溶液制備 按處方比例制備不含淫羊藿和杭白菊的陰性對照樣品，并按照“2．2．2”項下供試品溶液的制備方法，制得陰性對照溶液。

2．3 干擾實驗 按照“2．1”項下的色譜條件，分別對上述對照品、供試品、陰性樣品溶液進樣10μL。結(jié)果陰性樣品在與供試品和混合對照品相同保留時間處，無干擾峰的出現(xiàn)，可確定丹七明目散提取物中其他藥材成分對淫羊藿苷和木犀草素的含量測定不產(chǎn)生干擾，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A．混合對照品；B．供試品；C．陰性對照；1．木犀草素；2．淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatograms of reference substance（A），sample（B）and negative control（C）1．luteolin；2．icariin

2．4 線性關(guān)系考察 精密吸取淫羊藿苷和木犀草素對照品母液，各1，2，4，6，8 mL置10 mL量瓶中，分別用甲醇定容，將定容后的溶液進樣，并且按“2．1”色譜條件測定，以對照品的濃度（X，mg·mL－1）為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線。淫羊藿苷和木犀草素的回歸方程分別為：Y＝12 304X＋7．642 0（r＝0．999）；Y＝18 857X－9．912 9（r＝0．999 8）。結(jié)果表明，淫羊藿苷進樣濃度在0．02～0．16 mg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；木犀草素進樣濃度在0．008～0．064 mg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2．5 精密度試驗 取淫羊藿苷和木犀草素混合對照品溶液，重復進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果淫羊藿苷峰面積RSD為0．85%（n＝6），木犀草素的峰面積RSD為0．53%（n＝6）。

2．6 重復性試驗 取同樣的供試品，按“2．2．2”項下方法制備供試液，進樣6次，分別測定峰面積，其中淫羊藿苷的RSD為0．59%（n＝6），木犀草素的RSD為1．01%（n＝6）。

2．7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12，24 h按上述色譜條件試驗，分別記錄淫羊藿苷和木犀草素峰面積值，其峰面積的RSD分別為0．25%，0．83%。

2．8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批藥材約1．90 g，再分別已按相當于藥材含量的約80%、100%、120%量加入淫羊藿苷和木犀草素對照品溶液。由“2．2．2”項下的方法制備供試品溶液，進樣分析，由測得量與加入量計算回收率，結(jié)果見表2，表明方法回收率良好。

表2 淫羊藿苷和木犀草素的回收率（n＝9）Tab 2 Recovery rates of Icariin and luteolin（n＝9）

2．9 樣品含量測定 精密稱取同一批次的3份藥材樣品，并按“2．2．2”項下供試品處理方法制備溶液，依法測定，記錄峰面積，外標法計算藥材中淫羊藿苷和木犀草素的含量，結(jié)果見表3。

表3 丹七明目散中淫羊藿苷和木犀草素含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 The contents of icariin and luteolin in Danqimingmusan（n＝3）

3 討論

參考2010年中國藥典第一部以及其他相關(guān)報道，淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收［5－7］，木犀草素在350 nm處有最大吸收［8－10］。但在實際的研究中發(fā)現(xiàn)，280～350 nm之間木犀草素的峰高變化沒有太大區(qū)別，故最終采用270 nm。本研究采取梯度洗脫的方式。在梯度洗脫的方式中，作者嘗試選擇乙腈和水、乙腈和0．1%磷酸溶液和乙腈和0．3%磷酸溶液的3種流動相，然而結(jié)果中發(fā)現(xiàn)乙腈和0．1%磷酸溶液對供試品的峰型分離最優(yōu)，故最終采用乙腈和0．1%磷酸溶液。

本實驗首次建立了用HPLC測定丹七明目散中淫羊藿苷和木犀草素含量的方法，在含量測定的色譜條件下，淫羊藿苷和木犀草素與其他組分能夠達到較好分離，精密度、線性關(guān)系、重復性均符合測定要求，可為丹七明目散的質(zhì)量控制提供可借鑒的定量方法。并且在后期研究該藥物的藥理機制中提供較有價值的相關(guān)參考。

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