佟仲生 劉曉東 史業(yè)輝 李淑芬 王 忱 郝春芳

近年來(lái)，隨著新型光敏劑和激光設(shè)備的研制開(kāi)發(fā)迅速發(fā)展，光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）因其特異性高、選擇性強(qiáng)、并發(fā)癥少以及不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，使其成為繼手術(shù)、放療和化療后的又一項(xiàng)治療腫瘤的重要方法。亞甲藍(lán)（methylene blue，MB）作為一種古老的藥物，目前已廣泛應(yīng)用于解毒、鎮(zhèn)痛、染色標(biāo)記等臨床工作中［1-3］。自發(fā)現(xiàn)其光動(dòng)力治療作用以來(lái)，因其經(jīng)濟(jì)、無(wú)需避光、吸收光譜寬、安全等優(yōu)勢(shì)，成為光動(dòng)力治療研究的熱點(diǎn)之一。PDT聯(lián)合化療已經(jīng)成為世界研究的熱點(diǎn)，但是大部分研究主要限于空腔臟器腫瘤，對(duì)于乳腺癌等實(shí)質(zhì)臟器的研究尚少，且其抗腫瘤的機(jī)制尚未完全清楚［4］。本研究通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，初步探討亞甲藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法及聯(lián)合阿霉素對(duì)乳腺癌的抗腫瘤作用及其機(jī)制，為其治療乳腺癌的臨床應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

632 nm半導(dǎo)體激光光動(dòng)力治療儀購(gòu)自天津市雷意激光技術(shù)有限公司。亞甲藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，4℃避光保存，PBS配制成10 mM的母液，使用時(shí)以RPMI 1640稀釋成不同濃度工作液。胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。Rhodamine 123購(gòu)自江蘇碧云天公司。凋亡流式試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1由天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院免疫室饋贈(zèng)。BALB/c小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照（control）組、阿霉素（adriamycin，ADM）組、光動(dòng)力治療（PDT）組及聯(lián)合治療組（PDT+ADM）。每組設(shè)3復(fù)孔。ADM組：加入使用完全培養(yǎng)基（含90%RPMI 1640及10%胎牛血清）配制的不同濃度梯度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL）的阿霉素；PDT組：加入使用RPMI 1640培養(yǎng)液配制的不同濃度梯度（5、10、15、20、25 μM）的亞甲藍(lán)，孵育3h后給予激光照射；聯(lián)合治療組：加入使用完全培養(yǎng)基配制的濃度為0.50 μg/mL的阿霉素孵育24h，再加入使用RPMI 1640培養(yǎng)液配制的不同濃度梯度（5、10、15、20、25 μM）的亞甲藍(lán)，孵育3 h后給予激光照射。PDT組及聯(lián)合治療組光照能量密度為2.5 J/cm2，光照結(jié)束后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16 h。各孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，置搖床上充分震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇562nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔OD值。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及壞死 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞，接種于6孔板，孵育過(guò)夜。給予不同組別相應(yīng)處理：ADM組濃度為0.50 μg/mL，PDT組MB濃度為15 μM，聯(lián)合治療組ADM及MB濃度分別為0.50 μg/mL及15 μM，具體給藥方法及激光照射參照上述MTT實(shí)驗(yàn)。激光照射結(jié)束后棄去原RPMI 1640培養(yǎng)液，換加完全培養(yǎng)基3 mL，繼續(xù)孵育細(xì)胞24h。24 h后消化收集細(xì)胞，1 000 rpm離心5 min，PBS洗滌2次；加入Annexin V-FITC及PI各5 μL，避光孵育15 min，加入緩沖液400 μL，送檢。

1.2.3 線(xiàn)粒體膜電位變化檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞，接種于6孔板，孵育過(guò)夜，給予不同組別相應(yīng)處理（同凋亡及壞死檢測(cè)實(shí)驗(yàn)），激光照射結(jié)束后繼續(xù)避光孵育細(xì)胞2 h，PBS沖洗3次，加入終濃度為10 μg/mL的線(xiàn)粒體探針Rhodamine123，避光孵育30 min，孵育結(jié)束后，棄去所有孔內(nèi)的培養(yǎng)基，PBS洗滌3次。消化并離心細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞2次，于熒光顯微鏡下觀(guān)察，或行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 小鼠荷瘤實(shí)驗(yàn) 選取清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠，鼠齡6～8周，體質(zhì)量17～20 g。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌4T1細(xì)胞，將單細(xì)胞懸液接種于小鼠左后肢腹股溝內(nèi)側(cè)皮下。待小鼠瘤體長(zhǎng)至近1 cm3的實(shí)體瘤，取皮下移植瘤，在無(wú)菌條件下去包膜，剪成0.001 cm3的均勻組織塊備用。選取24只雌性BALB/c小鼠，脫毛液將小鼠左側(cè)腹股溝毛脫凈，再將腫瘤組織塊植入小鼠左后肢腹股溝內(nèi)側(cè)皮下，待移植瘤直徑達(dá)到0.6～0.8 cm，進(jìn)行隨機(jī)分組。將24只荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組（每組6只）：空白對(duì)照組；ADM組（ADM 2 mg/kg），1次/周，共3次；PDT組（亞甲藍(lán)50 mg/kg），總照射劑量為240 J/cm2，同時(shí)避光24 h，1次/周，共3次；、聯(lián)合治療組（ADM 2 mg/kg+亞甲藍(lán)50 mg/kg）。每次化療藥物注射時(shí)間相同，化療藥物注射12 h后腹腔注射亞甲藍(lán)，12 h后進(jìn)行激光照射，總照射劑量為240 J/cm2。在治療前測(cè)量小鼠腫瘤體積，治療后每2d測(cè)量1次，直至治療后的第21d。瘤體體積的計(jì)算公式：V（cm3）=d2（cm2）×D（cm）/2，d和D分別為腫瘤的最短徑和最長(zhǎng)徑［5］。至治療后的第21d，采用頸椎脫位術(shù)處死每組小鼠并取腫瘤組織大體標(biāo)本。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PDT及聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

ADM組抑制乳腺癌細(xì)胞4T1生長(zhǎng)呈濃度依賴(lài)性，濃度為0.50、1.00、2.00及4.00 μg/mL，各組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1A）。計(jì)算出ADM組半數(shù)藥物抑制濃度（IC50）為0.67 μg/mL，選取0.5 μg/mL為聯(lián)合給藥及后續(xù)研究給藥濃度。PDT組亞甲藍(lán)濃度為10、15、20、25 μM，各組與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）。計(jì)算出PDT組IC50為17 μM。選取15 μM為后續(xù)實(shí)驗(yàn)給藥濃度。聯(lián)合治療組各組與空白對(duì)照組比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。聯(lián)合治療組與PDT組進(jìn)行組間比較，各濃度組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1B）。本研究濃度為0.50 μg/mL ADM組抑瘤率為26%（0.68/2.62），濃度為15 μM PDT組抑瘤率為40%（1.06/2.64），聯(lián)合治療組抑瘤率為71%（1.90/2.67），經(jīng)計(jì)算聯(lián)合治療Q值約為1.28，顯示ADM及PDT具有良好的協(xié)同增效作用。

圖1 PDT聯(lián)合ADM對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞體外生長(zhǎng)抑制作用Figure1 In vitro inhibitory action of PDT and ADM on mammary carcinoma cell growth in 4T1 mouse

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，ADM組細(xì)胞凋亡及壞死率均較低，PDT組以早期及晚期凋亡為主，聯(lián)合治療組細(xì)胞死亡率較高，主要以晚期凋亡及壞死為主，早期凋亡細(xì)胞較少。與空白對(duì)照組比較，ADM組、PDT組及聯(lián)合治療組細(xì)胞總死亡率比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。聯(lián)合治療組細(xì)胞總死亡率高達(dá)（87.1%±1.9）%，與ADM組及PDT組比較均具有顯著性差異（P＜0.05，圖2）。

2.3 線(xiàn)粒體膜電位變化

熒光顯微鏡觀(guān)察：空白對(duì)照組細(xì)胞狀態(tài)良好，線(xiàn)粒體熒光探針定位于胞漿內(nèi)，顯示為綠色熒光，胞漿著色深；ADM組胞漿熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯變化；PDT組部分細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱；聯(lián)合治療組大部分細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯減弱（圖3）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：ADM組和空白對(duì)照組比較，線(xiàn)粒體膜電位未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05），而PDT組及聯(lián)合治療組與空白對(duì)照組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合治療組與PDT組組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞死亡情況Figure2 Cell death determined by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining

圖3 熒光顯微鏡下觀(guān)察各組細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位變化Figure3 Change in MMP observed under a fluorescent microscope after Rhodamine123 staining

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組線(xiàn)粒體膜電位變化Figure4 Change in MMP measured by flow cytometry after Rhodamine123 staining

2.4 荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況

空白對(duì)照組及ADM組可見(jiàn)腫瘤增長(zhǎng)較快，PDT組及聯(lián)合治療組早期可見(jiàn)腫瘤表面紅腫，2～3d瘤體表面出現(xiàn)局部壞死，壞死程度加深，壞死組織脫落，結(jié)痂，因腫瘤基底部仍繼續(xù)生長(zhǎng)，壞死腫瘤邊緣隆起，腫瘤呈火山口狀，部分腫瘤逐漸縮小甚至完全消失。PDT組及聯(lián)合治療組分別有1只及2只小鼠腫瘤達(dá)到完全緩解，且連續(xù)觀(guān)察10周未見(jiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。治療前，各組小鼠的腫瘤體積無(wú)明顯差異，治療第7、9及15d，各治療組和空白對(duì)照組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各治療組組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第11及13d，僅PDT組及聯(lián)合治療組和空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而各治療組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第17及19d，PDT組及聯(lián)合治療組與空白對(duì)照組及ADM組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），ADM組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第21d，PDT組僅與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合治療組與空白對(duì)照組及ADM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。整個(gè)治療過(guò)程中，聯(lián)合治療組瘤體明顯小于PDT組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5A）。治療后第21d處死小鼠，均剝離腫瘤稱(chēng)重（圖5B），空白對(duì)照組腫瘤體質(zhì)量（3.21±1.01）g，ADM組腫瘤體質(zhì)量（2.09±0.86）g，PDT組腫瘤體質(zhì)量（1.18±0.61）g，聯(lián)合治療組腫瘤體質(zhì)量（0.74±0.53）g。

圖5 PDT聯(lián)合ADM對(duì)小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)的影響Figure5 PDT and ADM inhibition on cell growth of 4T1 mouse mammary carcinoma in normal BALB/c mice

3 討論

隨著對(duì)PDT治療腫瘤研究的深入，近年來(lái)許多學(xué)者不斷嘗試各種PDT聯(lián)合方案，旨在進(jìn)一步提高PDT的抗腫瘤療效，其中PDT聯(lián)合化療受到越來(lái)越多的關(guān)注。Khdair等［7］發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)介導(dǎo)的PDT聯(lián)合阿霉素能夠?qū)δ退幍哪[瘤細(xì)胞顯示出強(qiáng)大的細(xì)胞毒性，這兩種藥物在耐藥細(xì)胞中的濃度較前明顯增高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)P-糖蛋白的表達(dá)下降以及活性氧簇的大量聚集，最終導(dǎo)致耐藥腫瘤細(xì)胞的壞死或者凋亡。本研究中亞甲藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力治療顯示良好的抗腫瘤效應(yīng)，并呈劑量依賴(lài)性。體外及體內(nèi)結(jié)果均提示聯(lián)合治療優(yōu)于單純化療或光動(dòng)力治療，符合臨床綜合治療要求。兩種治療方法相互作用，也可能是聯(lián)合治療組治療效果明顯的一個(gè)重要原因。PDT和化療均能促進(jìn)細(xì)胞凋亡和腫瘤的壞死，但是其具體的作用機(jī)制是不同的，可能存在交叉的信號(hào)通路，因此兩種治療方法聯(lián)合可以彌補(bǔ)各自的缺點(diǎn)，發(fā)揮較強(qiáng)的抗腫瘤作用。

Canti等［8］以低劑量的化療藥物聯(lián)合PDT治療小鼠荷瘤模型，發(fā)現(xiàn)盡管單獨(dú)應(yīng)用低劑量化療藥物并無(wú)抑瘤作用，但聯(lián)合PDT治療可大大增強(qiáng)抗腫瘤效果。最近的研究報(bào)道，觀(guān)察苯卟啉衍生物單環(huán)酸A介導(dǎo)的光動(dòng)力療法聯(lián)合阿霉素治療小鼠移植瘤，發(fā)現(xiàn)兩者具有顯著的增效作用，且能明顯延長(zhǎng)小鼠生存期，雖然聯(lián)合治療組存在一定的不良反應(yīng)，但是小鼠可以耐受，未見(jiàn)小鼠異常死亡［9］。本研究中采用PDT聯(lián)合低劑量阿霉素治療，結(jié)果顯示小鼠耐受性良好，毒副反應(yīng)輕，而抑瘤效果得到加強(qiáng)，說(shuō)明給予低劑量阿霉素亦可達(dá)到增效作用，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似［8］。ADM組在治療初期腫瘤生長(zhǎng)較緩慢，而在第15d后腫瘤增長(zhǎng)加快，提示單純化療在腫瘤體積較小時(shí)具有良好的抗腫瘤效應(yīng)，而在瘤體較大時(shí)療效欠佳。而PDT組在整個(gè)治療過(guò)程中抑瘤效果顯著，顯示PDT有良好的腫瘤局部控制作用。聯(lián)合治療組抑瘤率達(dá)到76.95%，高于A(yíng)DM組及PDT組，顯示出良好的增效作用，與其他文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似［10-11］。Ahn等［12］采用EMT6乳腺癌細(xì)胞系建立荷瘤小鼠模型，給予光敏劑血卟啉衍生物腹腔內(nèi)注射，以不同光照劑量分組治療，結(jié)果顯示高于90 J/cm2光照劑量時(shí)瘤體可以達(dá)到完全緩解。本研究PDT組及聯(lián)合治療組分別有1只及2只小鼠治療效果達(dá)到完全緩解，說(shuō)明PDT聯(lián)合化療能有效治療乳腺癌，部分腫瘤可能達(dá)到完全緩解，為臨床綜合治療乳腺癌提供一項(xiàng)新的選擇。阿霉素在心肌細(xì)胞中聚集而導(dǎo)致心肌毒性，限制了該藥物的臨床應(yīng)用。在之前的研究中，研究人員觀(guān)察到聯(lián)合治療極大改善了光敏劑及阿霉素在敏感性細(xì)胞中的細(xì)胞毒性，而且還增加對(duì)耐藥性細(xì)胞的聯(lián)合細(xì)胞毒性作用［7］。聯(lián)合治療一方面可以降低阿霉素的有效劑量，另一方面導(dǎo)致耐藥性腫瘤細(xì)胞的凋亡及壞死比率增加。本研究結(jié)果顯示PDT聯(lián)合ADM達(dá)到較好的腫瘤抑制作用，同時(shí)可以降低阿霉素劑量，減低心肌組織內(nèi)的分布，從而減少其心肌毒性。

線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)死亡信號(hào)途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要的細(xì)胞器，凋亡過(guò)程中的許多關(guān)鍵過(guò)程集中于線(xiàn)粒體上。線(xiàn)粒體膜電位在維持線(xiàn)粒體膜的完整性和功能方面起重要的作用，而線(xiàn)粒體膜電位下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志［13］。本研究發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法及聯(lián)合治療可顯著降低細(xì)胞的線(xiàn)粒體膜電位，提示線(xiàn)粒體途徑在PDT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。阿霉素主要作用部位是細(xì)胞核，藥物進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合，從而抑制核酸的合成和有絲分裂，而光動(dòng)力治療主要作用于胞漿，尤其是線(xiàn)粒體，因而光動(dòng)力聯(lián)合阿霉素化療可以通過(guò)不同途徑來(lái)達(dá)到增效的目的。

綜上所述，亞甲藍(lán)介導(dǎo)的光動(dòng)力療法對(duì)乳腺癌細(xì)胞及移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用明顯，聯(lián)合阿霉素可增強(qiáng)抑瘤效果。體外實(shí)驗(yàn)表明光動(dòng)力療法抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞增殖呈濃度依賴(lài)性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明光動(dòng)力療法可以明顯抑制小鼠乳腺癌皮下移植瘤生長(zhǎng)，而聯(lián)合阿霉素可以增強(qiáng)抑瘤作用。細(xì)胞水平光動(dòng)力治療以凋亡為主，其機(jī)制可能與降低腫瘤細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位相關(guān)。

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