趙 煜 張 濤 譚 勇 彭晶晶 周進軍 許 濤 付曾強

手術、化療和放療是傳統(tǒng)的三大腫瘤治療手段，生物治療以其獨特的優(yōu)勢在腫瘤治療中也占有一席之地，而免疫治療是腫瘤生物治療的核心。正常情況下，人體以細胞免疫為主發(fā)揮著抗腫瘤的作用，而在人體免疫功能作用下仍能發(fā)生腫瘤，其原因可能與腫瘤逃避機體免疫監(jiān)視，使機體不能有效的遞呈腫瘤抗原，以致不能有效活化細胞毒性T細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）有關［1］。DC是機體功能最強的抗原遞呈細胞（antigen presenting cells，APCs），能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原。細胞因子對DC的發(fā)育、成熟及免疫功能的發(fā)揮至關重要。許多細胞因子：IL-2、IL-12、粒-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等作為DC的免疫佐劑，使其誘導的T細胞反應得以增強。IL-15是一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子，具有與IL-2類似的激活T、B細胞和NK細胞的作用［2-4］。本研究以IL-2為對照，觀察IL-15對DC疫苗誘導的T淋巴細胞免疫反應的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

IL-15購自英國Peprotech公司。IL-2、IL-4、PE-Cy5-CD8 mAb、PE-CD44 mAb、PE-CD62L mAb、PE-CD69 mAb購自美國eBioscience公司。GM-CSF購自美國R&D公司。脂多糖（LPS）購自美國Sigma公司。ELISPOT試劑盒購自瑞士Mabtech公司。C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡購自四川大學實驗動物中心。Levis肺癌細胞株由本實驗室保種儲存。

1.2 方法

1.2.1 凍融法制備Levis細胞抗原 取對數(shù)生長期的Levis細胞，用PBS重懸腫瘤細胞為2×107/mL。置于液氮10 min后放于37℃水浴中融化，反復4個循環(huán)。離心取上清即制成含Levis細胞的腫瘤細胞裂解液，置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠骨髓DC（BMDCs）的制備及培養(yǎng) 無菌取小鼠股骨和脛骨，用注射器吸取RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗髓腔，沖洗液離心后棄上清。用紅細胞裂解液裂解紅細胞，離心后棄上清。用含5%FCS、1 000 U/mL GM-CSF、500U/mL IL-4的RPMI 1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為6×105/mL，加入6孔板中（1.8×106/孔）培養(yǎng)。第8天加入含2×107/孔腫瘤細胞裂解液0.1 mL，培養(yǎng)4 h后加入0.1 mL脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）混勻誘導細胞成熟。

1.2.3 小鼠脾臟T淋巴細胞的制備及培養(yǎng) 無菌取小鼠脾臟，注射器芯研磨脾臟濾過200目鋼網(wǎng)，加紅細胞裂解液裂解紅細胞后，用3 mL RPMI 1640培養(yǎng)基重懸置孵箱備用。將尼龍毛柱加入37℃的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃孵箱中1h平衡柱子，取出尼龍毛柱加入脾細胞懸液3 mL，37℃孵育45 min。加入20 mL預熱為37℃的RPMI 1640培養(yǎng)基，以1滴/s的速度洗柱收集濾過液，得到脾臟T淋巴細胞懸液，調整細胞濃度為3×106/mL。

1.2.4 淋巴細胞免疫表型測定 采用流式細胞術直接免疫熒光標記法檢測淋巴細胞免疫表型。分別收集培養(yǎng)第3、7、14天的各組（IL-2、IL-15）T淋巴細胞，調整細胞濃度為1×106/mL，吸取l mL用PBS洗滌后，加入60 μL PBS緩沖液及各（PE-Cy5-CD8、PE-CD44、PE-CD62L、PE-CD69）單克隆抗體（mAb）40 μL，室溫避光孵育40 min。每組共設3個復孔，PBS洗滌后行流式細胞儀檢測。

1.2.5 腫瘤抗原負載BMDCs誘導的T細胞對腫瘤細胞殺傷活性的分析 無菌取健康小鼠的脾臟淋巴細胞，制備T淋巴細胞懸液。調整T淋巴細胞濃度為1×106/mL，于6孔板中加入600 μL/孔細胞懸液。腫瘤抗原負載的BMDCs用RPMI 1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×105/mL，于置有T淋巴細胞的6孔板中加入300 μL/孔細胞懸液，補足培養(yǎng)基為3 mL，每組分別加入10 ng/mL IL-2、125 ng/mL IL-15孵箱孵育。7 d后收集懸浮細胞，以含10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋作為效應細胞備用。取l mL濃度為3×106/mL的Levis細胞為靶細胞，加入100Ci Na51CrO4混勻后置于孵箱孵育2 h。Hanks液洗滌3次后用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸并調整細胞濃度為1×106/mL。將各效應細胞與靶細胞按照效靶比（E∶T）為160∶l、80∶1、40∶1、20∶1加入到96孔U型板中，各設3個復孔。同時設最大釋放組（100 μL靶細胞、100 μL破膜劑1%triton-X100），最小釋放組（100 μL靶細胞、100 μL RPMI 1640培養(yǎng)基）于孵箱孵育4 h。離心后收集上清100 μL于專用試管中。用γ記數(shù)器測定每管上清液的51Cr釋放量。51Cr釋放率=（樣本釋放cpm平均值-最小釋放cpm平均值）/（最大釋放cpm平均值-最小釋放cpm平均值）×100%。

1.2.6 IFN-γ分泌細胞的檢測 實驗操作步驟按照ELISPPOT試劑盒說明書操作。調整效應細胞濃度為1×106/mL，于96孔培養(yǎng)板中加入100 μL/孔細胞懸液，各設3個復孔，孵育時間為24 h。將ELISPPOT板置于解剖顯微鏡下（×40），記錄黑紫色斑點，拍照。行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-15或IL-2對T淋巴細胞免疫表型的影響

為研究IL-15或IL-2聯(lián)合DC疫苗對T淋巴細胞免疫表型的影響，本研究對激活的T淋巴細胞采用流式細胞術分析了CD8+T細胞的表型特征，如CD69、CD62L、CD44。采用不同濃度的IL-2（5、10、20或40 ng/mL），IL-15（25、125、250或 500 ng/mL）培養(yǎng)淋巴細胞，以3、7和14d為時間梯度檢測淋巴細胞免疫表型。結果提示：在第7天時，10 ng/mL IL-2或125 ng/mL IL-15上調CD8+T細胞表達CD69、CD44分子情況較好，同時下調CD62L分子情況亦較好。本實驗選取第7天時，以10 ng/mL IL-2和125 ng/mL IL-15的條件檢測T淋巴細胞的殺傷活性和分泌IFN-γ的細胞數(shù)量（圖1）。

2.2 腫瘤抗原負載BMDCs誘導的T細胞對腫瘤細胞殺傷活性的影響

為了觀察激活的T淋巴細胞對特異性抗原腫瘤細胞的殺傷作用，本研究采用51Cr釋放法檢測T淋巴細胞的殺傷活性。結果表明，在聯(lián)合DC疫苗的情況下，IL-15或IL-2作為免疫佐劑對靶細胞的殺傷活性無顯著差別，但兩者均顯著高于對照組（圖2）。

圖1 流式細胞術分析CD8+T細胞的表型特征Figure1 Phenotypic characteristics of CD8+T-cell populations analyzed by flow cytometry

圖2 T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷活性的分析Figure2 Cytotoxic T lymphocyte-mediated cytotoxicity assay after stimulation with BMDCs

2.3 分泌IFN-γ細胞數(shù)量的檢測

為研究IL-15或IL-2對淋巴細胞免疫反應的影響，本研究取健康小鼠脾臟制備T淋巴細胞，將DC疫苗與T淋巴細胞混合培養(yǎng)，同時分別加入10 ng/mL IL-2或125 ng/mL IL-15，7d后收集培養(yǎng)的細胞行ELISPOT實驗，檢測分泌IFN-γ的細胞數(shù)量。結果顯示，經(jīng)DC疫苗刺激后，用含IL-15的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每10萬個細胞約有50個IFN-γ分泌細胞；而用含IL-2培養(yǎng)基培養(yǎng)，每10萬個細胞約有30個IFN-γ分泌細胞，有顯著性差異（P＜0.05）。為了排除細胞因子的非特異性刺激作用，本研究采用無DC疫苗的IL-15或IL-2為對照，在無DC疫苗的刺激下，僅有IL-15或IL-2較難刺激淋巴細胞分泌IFN-γ（圖3）。

圖3 分泌IFN-γ細胞數(shù)量的檢測Figure3 Number of IFN-γ secreting cells after stimulation with BMDCs

3 討論

DC遞呈抗原的能力遠強于B淋巴細胞、巨噬細胞等其他APCs，其能誘導CTL的抗腫瘤免疫反應［5］，同時也是細胞免疫應答的啟動者，可以活化初始T細胞。DC與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系。腫瘤患者體內的DC數(shù)量和功能都有所下降，從而使T細胞介導的免疫應答不能被有效的激活［6］。因此如何改善和提高DC誘發(fā)的免疫反應，是腫瘤免疫學研究的熱點。

IL-2常作為DC的免疫佐劑使其誘導的T細胞反應得以增強，而IL-15在抗腫瘤免疫治療方面的應用也得到了研究者的關注，其具備一些IL-2不具備的優(yōu)勢，如IL-15能激活和擴增CD8+T細胞［7-8］；不激活調節(jié)性T淋巴細胞（regulatory T cells，Tregs），并解除Tregs對T細胞的抑制作用，而Tregs對免疫的各個方面都有負調節(jié)作用［9-12］；IL-15不會引起激活誘導的細胞死亡（activation-induced cell death，AICD）。而IL-2卻抑制記憶性T細胞在體內的生存，激活并維持Tregs的活性和功能，而且能誘導AICD［13］。

本研究顯示，初始T淋巴細胞在體外經(jīng)DC疫苗刺激后，用IL-15或IL-2均能刺激IFN-γ的分泌，并維持和擴增抗原特異性CTL。雖然IL-15較IL-2能刺激更多的IFN-γ分泌細胞產生，但在特異性殺傷活性方面并未顯示出優(yōu)勢，這可能與初次免疫反應較弱，刺激時間不夠長有關。

IL-15作為一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子，在三級結構上與IL-2相似，兩者都屬于4-螺旋的造血因子家族。IL-15受體（IL-15R）與IL-2受體（IL-2R）相似，均包含3條鏈，分別命名為IL-15Rα、β、γ，其中β和γ亞單位與IL-2的β和γ亞單位相同；同時兩種細胞因子的信號轉導通路都包含蛋白酪氨酸激酶（janus kinase，JAK）和信號傳導及轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）［14］。正因這兩種細胞因子的受體具有相同的β、γ亞單位和信號轉導分子，可以解釋本研究觀察到的IL-15與IL-2具有刺激T淋巴細胞增殖，維持T淋巴細胞活性的作用。

而IL-15Rα與IL-2Rα不同，IL-15Rα在機體的表達更為廣泛，主要在激活的單核細胞、DC及基質細胞表達。而IL-2Rα主要由激活的T細胞和B細胞表達，IL-2Rα又名CD25，是Treg細胞的表型標記，部分經(jīng)IL-2激活的淋巴細胞可能會轉換成Treg細胞，限制免疫反應的進一步進行。

IL-2促使T-B細胞或T-T細胞之間的FasL（CD95L）和Fas（CD95）相結合，啟動活化誘導的細胞死亡，是CTL和NK細胞殺傷的機制之一，同時也可殺傷活化的T、B細胞，下調細胞免疫和體液免疫。雖然IL-2是一個強的淋巴細胞增殖刺激因子，但是長期大量的使用反而可能會通過以上這些機制限制免疫反應的進行。而目前未發(fā)現(xiàn)IL-15下調細胞免疫和體液免疫。

鑒于以上分析，在抗腫瘤免疫治療中，本研究認為IL-15可能是較IL-2更好的免疫佐劑，進一步的體內抗腫瘤免疫動物實驗研究是今后擬進行的工作。

1 Dermime S,Gilham DE,Shaw DM,et al.Vaccine and antibody-directed T cell tumor immunotherapy[J].Biochim Biophys Acta,2004,1704(1):11-35.

2 Qian L,Zhang Y,Pan XY,et al.IL-15,in synergy with RAE-1ε,stimulates TCR-independent proliferation and activation of CD8(+)T cells[J].Oncol Lett,2012,3(2):472-476.

3 Tamang DL,Redelman D,Alves BN,et al.Induction of granzyme B and T cell cytotoxic capacity by IL-2 or IL-15 without antigens:multiclonal responses that are extremely lytic if triggered and short-lived after cytokine withdrawal[J].Cytokine,2006,36(3-4):148-159.

4 Popmihajlov Z,Xu D,Morgan H,et al.Conditional IL-2 gene deletion:consequences for T cell proliferation[J].Front Immunol,2012,3:102.

5 Mayordomo JI,Zorina T,Storkus WJ,et al.Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity[J].Nat Med,1995,1(12):1297-1302.

6 Liu JY,Wu Y,Zhang XS,et al.Single administration of low dose cyclophosphamide augments the antitumor effect of dendritic cell vaccine[J].Cancer Immunol Immunother,2007,56(10):1597-1604.

7 Alenzi FQ,Alenazi FA,Al-Kaabi Y,et al.The use of growth factors to modulate the activities of antigen-specific CD8+T cells in vitro[J].J Med Life,2011,4(4):399-406.

8 Castro I,Yu A,Dee MJ,et al.The basis of distinctive IL-2-and IL-15-dependent signaling:weak CD122-dependent signaling favors CD8+T central-memory cell survival but not T effector-memory cell development[J].J Immunol,2011,187(10):5170-5182.

9 Ben Ahmed M,Belhadj Hmida N,Moes N,et al.IL-15 renders conventional lymphocytes resistant to suppressive functions of regulatory T cells through activation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway[J].J Immunol,2009,182(11):6763-6770.

10 Van Belle TL,Dooms H,Boonefaes T,et al.IL-15 augments TCR-induced CD4+T cell expansion in vitro by inhibiting the suppressive function of CD25 High CD4+T cells[J].PLoS One,2012,7(9):e45299.

11 Ahmadzadeh M,Rosenberg SA.IL-2 administration increases CD4+CD25(hi)Foxp3+regulatory T cells in cancer patients[J].Blood,2006,107(6):2409-2414.

12 Grigoriadis G,Vasanthakumar A,Banerjee A,et al.c-Rel controls multiple discrete steps in the thymic development of Foxp3+CD4 regulatory T cells[J].PLoS One,2011,6(10):e26851.

13 Waldmann TA.The biology of interleukin-2 and interleukin-15:implications for cancer therapy and vaccine design[J].Nat Rev Immunol,2006,6(8):595-601.

14 Betts BC,Abdel-Wahab O,Curran SA,et al.Janus kinase-2 inhibition induces durable tolerance to alloantigen by human dendritic cell-stimulated T cells yet preserves immunity to recall antigen[J].Blood,2011,118(19):5330-5339.