吳大勇，張文艷，邊艷珠，胡玉敬

(河北省人民醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050051)

深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是導(dǎo)致肺動脈血栓栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE)的主要原因，51%～71%下肢 DVT 患者可能發(fā)生PTE[1]。DVT的影像診斷主要依靠超聲檢查，而超聲檢查不能分辨新鮮與陳舊靜脈血栓，因此存在明顯的不足[2]。

急性新鮮血栓中血小板活化后膜表面暴露帶負(fù)電荷磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)，膜連蛋白 V(Annexin V)依賴鈣離子能夠特異的與PS結(jié)合，具有納摩爾級的親和力[3]。

PTE誤診率、病死率高，西方國家DVT和PTE的年發(fā)病率分別為 0.1%和 0.05%[4]。急性靜脈血栓主要為新鮮混合血栓，其中混合血栓內(nèi)的白色血栓部分富含活化血小板，而形成時間較長的靜脈陳舊混合血栓，多發(fā)生機化血栓活化血小板明顯減少[5]。新鮮靜脈血栓較陳舊機化血栓脫落風(fēng)險更大，二者的鑒別對制定臨床治療計劃具有關(guān)鍵意義[6]。

根據(jù)與活化血小板結(jié)合的靶位點不同，血栓活化血小板顯像劑主要分為與GPIIbIIIa受體結(jié)合、與P-選擇素結(jié)合、與PS結(jié)合三類[7]。與GPIIbIIIa受體結(jié)合的顯像劑研究較多[8-11]，99Tcm-P280已被美國FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床急性下肢血栓顯像。但多肽制備成本高，價格昂貴，其應(yīng)用受到一定限制。季順東[12]、吳錦昌[13]、方緯[14]等利用99Tcm標(biāo)記國內(nèi)自行研制的P-選擇素單克隆抗體SZ-51成功對新鮮動脈、下肢深靜脈及肺動脈血栓顯像，但單克隆抗體相對分子質(zhì)量較大，血液清除較慢，顯像中本底較高，圖像質(zhì)量亦受到一定影響。

與PS結(jié)合的顯像劑主要為放射性核素標(biāo)記Annexin V，已有關(guān)于99Tcm-Annexin V對急性左房血栓[15]、腹主動脈瘤附壁血栓[16]、感染性心內(nèi)膜炎血栓性贅生物[17]、新鮮動脈血栓[18-20]顯像研究的報道。Rouzet F等[17]實驗中觀察到在制備感染性心內(nèi)膜炎動物模型過程中，因?qū)Ч軗p傷上腔靜脈內(nèi)壁形成的靜脈血栓攝取99Tcm-Annexin V以及肺內(nèi)栓子攝取99Tcm-Annexin V，這也為99Tcm-Annexin V靜脈血栓顯像及肺動脈栓塞血栓顯像提供了依據(jù)。

本實驗擬研究99Tcm-Annexin V在下腔靜脈血栓模型家兔的體內(nèi)分布，并對新鮮與陳舊靜脈血栓對99Tcm-Annexin V的攝取情況進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

ZD-6000井型γ計數(shù)锝分析儀：西安志達(dá)公司產(chǎn)品；鉬锝發(fā)生器：北京原子高科股分有限公司產(chǎn)品；Annexin V(Bender Medsystems公司)、氯化亞錫：分析純，天津市化學(xué)試劑三廠產(chǎn)品；新華1號濾紙：北京師范大學(xué)化學(xué)院惠贈；丙酮：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品；檸檬酸、檸檬酸鈉：分析純，天津市博迪化工股份有限公司產(chǎn)品；葡萄糖：分析純，天津市百世化工有限公司產(chǎn)品；酒石酸鉀鈉：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物

新西蘭家兔：15只，雌雄不拘，體重2.0～2.5 kg，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證編號為1009032。

2 實驗方法

2.1 99Tcm-Annexin V制備

取檸檬酸0.48 g、檸檬酸鈉1.32 g、葡萄糖1.47 g，置于燒杯中加100 mL蒸餾水，攪拌至充分溶解，制備檸檬酸葡萄糖溶液(ACD)待用。參照文獻(xiàn)[21]取一潔凈反應(yīng)瓶，加入Annexin V 30 μg、ACD溶液500 μL、酒石酸鉀鈉溶液(10 g/L)100 μL、SnCl2/HCl溶液(2 g/L)10 μL，搖勻，充分反應(yīng)，2～4 ℃冰箱冷藏20 min，加入高锝酸鈉溶液1 mL(1 110 GBq/L)，室溫下反應(yīng)20 min，完成標(biāo)記。利用新華1號濾紙為固定相、丙酮做展開劑，測定99Tcm-Annexin V 的Rf，測定99Tcm-Annexin V標(biāo)記率，室溫下及37 ℃恒溫箱保存1、2、3、4、5及8 h的放化純度。

2.2 下腔靜脈血栓模型家兔的建立

3%戊巴比妥鈉1～1.3 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉后固定于手術(shù)臺，右側(cè)腹備皮，沿腹直肌右外側(cè)線切開皮膚4～6 cm切口，逐層鈍性分離腹壁肌肉、腹膜，入腹腔后鈍性分離后腹膜，暴露右腎下極水平以遠(yuǎn)約4 cm長下腔靜脈，將長約3 cm自制單股螺旋銅絲向心方向穿刺入下腔靜脈留置，縫合血管，止血，觀察下腔靜脈回流通暢后回納腸管，逐層縫合腹膜、肌肉、皮膚。家兔術(shù)后清潔環(huán)境飼養(yǎng)。

2.3 99Tcm-Annexin V的家兔體內(nèi)分布

將15只實驗兔隨機分為新鮮血栓組、陳舊血栓組及對照組，每組5只。前兩組建立下腔靜脈血栓模型，對照組與血栓組進(jìn)行相同的手術(shù)過程，但未在下腔靜脈內(nèi)置入螺旋銅絲。新鮮血栓組與對照組于術(shù)后1 d進(jìn)行體內(nèi)分布實驗，陳舊血栓組于術(shù)后14 d進(jìn)行體內(nèi)分布實驗。

各組實驗兔均經(jīng)耳緣靜脈注射99Tcm-Annexin V 4 mCi，于注射99Tcm-Annexin V 1 h后均經(jīng)耳緣靜脈注射過量戊巴比妥鈉處死，分離組織、血栓，計算放射性攝取率。新鮮血栓組和陳舊血栓組分別取血栓、血液、血栓部位下腔靜脈血管、頭側(cè)下腔靜脈血管、后肢肌肉、胃、心、肺、肝、腎、脾、骨及小腸組織；對照組取對應(yīng)組織。將上述所取組織生理鹽水沖洗干凈，紗布粘干，測所取各組織及血液放射性計數(shù)并準(zhǔn)確稱重，計算所取標(biāo)本的放射性攝取率(%ID/g)。計算兩血栓組血栓分別與血液、血栓部位下腔靜脈血管、頭側(cè)下腔靜脈血管、肌肉的放射性攝取比(T/NT)。

2.4 病理檢查

兩血栓組血栓稱重及測量放射性計數(shù)完畢后，立即置于福爾馬林固定液中。將所留存血栓標(biāo)本進(jìn)行HE染色確定血栓病理特征。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果與討論

3.1 99Tcm-Annexin V標(biāo)記

測定99Tcm-Annexin V 的Rf為0.1。99Tcm-Annexin V標(biāo)記率為98%，室溫下及標(biāo)記后37 ℃恒溫水浴箱保存4 h內(nèi)放化純度均高于95%，8 h放化純度仍大于90%，標(biāo)記物體外穩(wěn)定性良好。

3.2 病理檢查

新鮮與陳舊血栓組血栓及病理圖示于圖1。新鮮血栓組實驗兔解剖后下腔靜脈內(nèi)肉眼均可見血栓形成，血栓沿螺旋銅絲紅白相間或以白色為主。陳舊血栓組解剖后肉眼亦均可見血栓形成，血栓沿螺旋銅絲紅白相間；對照組解剖后下腔靜脈內(nèi)未見血栓形成，下腔靜脈回流通暢。新鮮血栓組、陳舊血栓組實驗兔血栓重量分別為(0.058±0.013)g和(0.088±0.064)g。

3.3 99Tcm-Annexin V的家兔體內(nèi)分布

99Tcm-Annexin V在家兔體內(nèi)分布結(jié)果列于表1。新鮮血栓組、陳舊血栓組血栓放射性攝取率分別為(0.018 94±0.002 16)%ID/g、(0.004 73±0.001 28)%ID/g。新鮮血栓組血栓放射性攝取率與陳舊血栓組進(jìn)行兩樣本t檢驗，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.66，P<0.05)。新鮮血栓組血栓與血液、血栓與血栓部位下腔靜脈血管、血栓與頭側(cè)下腔靜脈血管、血栓與肌肉的T/NT分別為3.42±1.06、26.32±13.60、31.23±16.00、111.62±52.23，高于陳舊血栓組：0.98±0.09、5.12±2.01、6.25±2.38、21.82±5.93，兩組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行兩樣本t檢驗，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t分別為5.14、3.44、3.45、3.82 ，P<0.05)。

新鮮血栓組血栓病理證實均為新鮮混合血栓，鏡下見淡紅色珊瑚狀血小板小梁，小梁間纖維素網(wǎng)內(nèi)包含紅細(xì)胞，小梁邊緣有較多中性粒細(xì)胞粘附(見圖1a)；陳舊血栓組血栓病理證實均為陳舊機化混合血栓，鏡下見珊瑚狀血小板小梁，小梁間隙可見多量內(nèi)皮細(xì)胞分化趨勢細(xì)胞，小梁間纖維素網(wǎng)內(nèi)包含少量紅細(xì)胞及較多附著的中性粒細(xì)胞，呈機化表現(xiàn)(見圖1c)。新鮮的靜脈血栓較陳舊靜脈血栓含有更多的活化血小板，99Tcm-Annexin V的體內(nèi)分布數(shù)據(jù)反映了這一生理特性。新鮮血栓組血栓與血液的放射性攝取比為3.42±1.06，由數(shù)據(jù)推測利用99Tcm-Annexin V顯像，能夠獲得較清晰的圖像。但三組實驗兔血液放射性攝取率相對較高，可能顯像本底會相對較高。

a——新鮮血栓組血栓照片，血栓沿螺旋銅絲附著；b——病理(HE染色，放大40倍)，顯示為新鮮混合血栓，白色血栓與紅色血栓間或存在；c——陳舊血栓照片，血栓沿螺旋銅絲附著；d——病理(HE染色，放大40倍)，顯示為陳舊機化混合血栓，血栓小梁間隙可見多量血管內(nèi)皮細(xì)胞分化趨勢細(xì)胞，呈機化表現(xiàn)。圖1 新鮮與陳舊血栓組血栓及病理圖Fig.1 The thrombi of the fresh and old thrombus groups and the pathological section by Hematoxylin-eosin stains：

組織各組放射性攝取率/(%ID·g-1)新鮮血栓組陳舊血栓組對照組血栓 0.018 94±0.002 160.004 73±0.001 28血液0.005 81±0.001 170.004 77±0.000 920.005 92±0.002 20血栓部位下腔靜脈0.000 78±0.000 330.000 98±0.000 260.001 07±0.000 34頭側(cè)下腔靜脈0.000 69±0.000 240.000 81±0.000 24肌肉0.000 19±0.000 060.000 22±0.000 050.000 23±0.000 04肝0.012 94±0.006 090.006 88±0.005 940.010 47±0.008 16腎0.977 71±0.367 380.855 81±0.415 470.742 72±0.423 76脾臟0.000 90±0.000 340.001 02±0.000 450.001 08±0.000 54胃0.001 08±0.000 520.001 04±0.000 510.001 00±0.000 69骨0.000 70±0.000 250.001 28±0.001 840.000 72±0.000 39心0.004 15±0.004 770.001 11±0.000 450.001 54±0.001 04肺0.002 39±0.002 150.002 04±0.001 550.002 18±0.002 29小腸0.001 32±0.000 760.001 40±0.000 510.001 56±0.001 10

4 小結(jié)

新鮮靜脈血栓對99Tcm-Annexin V的攝取明顯高于陳舊靜脈血栓，且新鮮血栓組血栓與血液的放射性攝取比較高，通過體內(nèi)分布數(shù)據(jù)推斷，99Tcm-Annexin V有望應(yīng)用于新鮮靜脈血栓顯像，以及鑒別新鮮與陳舊靜脈血栓。

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