劉建英

(青島大學醫(yī)學院，山東 青島，266000)

神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma,NB)是兒童最常見的顱外惡性實體腫瘤之一，起源于胚胎發(fā)育期未分化成熟的神經(jīng)嵴細胞[1]。如何提高化療敏感性，逆轉(zhuǎn)耐藥是NB治療中亟待解決的難題。已有研究發(fā)現(xiàn)，TrKB(Tyrosine kinase receptor，TrKB)與BDNF(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)高表達是NB患者預后不良的生物學標記[2]。TrKB與BDNF結(jié)合后至少能激活三個重要的信號傳導通路，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)途徑和磷脂酶C(PLC)途徑,而這三條通路與細胞增殖及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[3]。本研究旨在探討 TrkB-BDNF及其下游信號轉(zhuǎn)導通路的激活是否與 NB 化療耐藥有關(guān)；研究阻斷該通路可否逆轉(zhuǎn)耐藥，試圖找到有效的能逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物，為臨床治療NB 提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與材料

SH- SY5Y NB 細胞系購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫；全反式維甲酸(美國 sigma 公司)；磷脂酶C(PLC)抑制劑 U73122(美國 sigma 公司)；絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑U0126(美國 sigma 公司)；磷脂酰肌醇-3激酶( PI3K)抑制劑LY294002(美國 sigma 公司)；BDNF(PeproTech,Inc產(chǎn)品)；DMEM培養(yǎng)液(Hyclone 公司)；McCoy's-5 A無血清培養(yǎng)基(美國 sigma 公司)；胎牛血清(Hyclone 公司)；順鉑(CDDP,山東齊魯制藥廠)；四甲基偶氮唑藍(MTT，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；Annexin—V-FITC試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1SH-SY5Y細胞培養(yǎng) 人NB細胞株SH-SY5Y培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。每日在倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時，按1∶2比例傳代細胞，實驗時取對數(shù)生長期細胞。

1.2.2MTT檢測細胞存活率 實驗分6組：均為對數(shù)生長期細胞。第1組為對照組；第2組為單用CDDP組；第3組為ATRA+BDNF+CDDP組；第4組為ATRA+BDNF+ LY294002+CDDP組；第5組為ATRA+BDNF+ U73122+CDDP組；第6組為ATRA+BDNF+ U0126+CDDP組.

取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，將細胞濃度調(diào)整至1 X 104/ml接種于96孔板中，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h后順鉑組及對照組繼續(xù)用DMEM 培養(yǎng)液，其他組改換含10 nM/L ATRA的DMEM培養(yǎng)液，5 d后再更換McCoy '5無血清培養(yǎng)液24 h后，按分組加藥。順鉑處理24 h后，行MTT分析：每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加150 μl DMSO，震蕩15 min，于1 h內(nèi)在酶標儀上分別測出波長570 nm處各孔吸光度(A)值，每組設(shè)3個復孔，取3次實驗的平均數(shù)，計算各組細胞的相對存活率(%)=(實驗組吸光度一空白組吸光度/對照組吸光度一空白組吸光度)X100% 。(ATRA應用濃度為10 nM/L，BDNF應用濃度為100ng/mL，CDDP應用濃度為5μg /mL，LY294002應用濃度為10μmol/L,U73122應用濃度為10μmol/L,U0126應用濃度為10μmol/L)。以上所有藥物濃度均為終濃度。

1.2.3FCM檢測細胞凋亡率 實驗分組同MTT分析：取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，將細胞濃度調(diào)整至 1X 105/mL接種于6孔板中，每組設(shè)2孔，培養(yǎng)24 h后1組及2組繼續(xù)用DMEM培養(yǎng)液，其他組改換含10 nM/L ATRA的DMEM培養(yǎng)液，5 d后再更換McCoy’5無血清培養(yǎng)液24 h后，按上述分組加藥。順鉑處理24 h后細胞以不含EDTA的0．25%胰酶消化，4°C預冷的PBS洗兩遍后加binding—bufer 500μL懸浮細胞，再加Annexin—V 5μL、PI5μL，室溫避光作用15 min后，于1h內(nèi)在流式細胞儀上檢測。本實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 TrKB-BDNF 的三條下游信號傳導通路對順鉑作用下NB細胞存活率的影響

ATRA+BDNF+CDDP組NB細胞的存活率與對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。TrKB-BDNF信號通路的下游信號通路PI3K/AKT被阻斷后，ATRA +BDNF+LY294002+CDDP組細胞對順鉑的敏感性增加，細胞的存活率明顯降低，與ATRA+BDNF+CDDP組相比，差異有顯著性(P<0.05),與單用順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；TrKB-BDNF信號通路的下游信號通路PLC被阻斷后，ATRA +BDNF+U73122+CDDP組細胞的存活率與ATRA+BDNF+CDDP組相比，差異無顯著性(P>0.05),與單用順鉑組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TrKB-BDNF信號通路的下游信號通路MAPK被阻斷后，ATRA +BDNF+U0126+CDDP組細胞的存活率與ATRA+BDNF+CDDP組相比，差異無顯著性(P>0.05),與單用順鉑組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(圖1)

1：對照組；2：CDDP組；3：ATRA+BDNF+CDDP組；4：ATRA+BDNF+ LY294002+CDDP組；5：ATRA+BDNF+ U73122+CDDP組；6：ATRA+BDNF+ U0126+CDDP組.

2.2 TrKB-BDNF 的三條下游信號傳導通路對順鉑作用下NB細胞凋亡率的影響

ATRA+BDNF+CDDP組NB細胞的凋亡率與對照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。TrKB-BDNF信號通路的下游信號通路PI3K/AKT被阻斷后，ATRA +BDNF+LY294002+CDDP組細胞對順鉑的敏感性增加，細胞的凋亡率明顯升高，與ATRA+BDNF+CDDP組相比，差異有顯著性(P<0.05),與單用順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；TrKB-BDNF信號通路的下游信號通路PLC被阻斷后，ATRA +BDNF+U73122+CDDP組細胞的凋亡率與ATRA+BDNF+CDDP組相比，差異無顯著性(P>0.05),與單用順鉑組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TrKB-BDNF信號通路的下游信號通路MAPK被阻斷后，ATRA +BDNF+U0126+CDDP組細胞的凋亡率與ATRA+BDNF+CDDP組相比，差異無顯著性(P>0.05),與單用順鉑組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(圖2)

1：對照組；2：CDDP組；3：ATRA+BDNF+CDDP組；4：ATRA+BDNF+ LY294002+CDDP組；5：ATRA+BDNF+ U73122+CDDP組；6：ATRA+BDNF+ U0126+CDDP組.

3 討 論

神經(jīng)母細胞瘤是兒童最常見的實體瘤之一，起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的原始細胞。在哺乳動物中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、NT-3、NT-4/5等共同組成神經(jīng)營養(yǎng)因子家族(NTs)。TrK是原癌基因TrK編碼的神經(jīng)營養(yǎng)酪氨酸激酶受體家族成員，包括TrKA、TrKB、TrKC三個亞型[4]。已有學者報道， TrKB受體主要表達于預后不良、伴有N-myc擴增的高分化期NB患兒，而N-myc是預后較差的疾病的可靠標志物之一，TrKB高表達是NB不良預后的生物標記[5]。NTs與TrK選擇性結(jié)合，BDNF主要與TrKB結(jié)合形成TrKB-BDNF信號傳導通路，該通路與腫瘤的關(guān)系首先是在對神經(jīng)母細胞瘤的研究中被闡明。TrKB與BDNF結(jié)合后能激活多個重要的信號傳導通路，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)途徑和磷脂酶C(PLC)途徑,而這三條通路與細胞增殖及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[3]。已有研究發(fā)現(xiàn)小劑量的全反式維甲酸(ATRA)對NB的生長無抑制作用，納摩爾濃度的ATRA能誘導TrKB表達并加入外源性BDNF的作用下，能夠抑制化療藥順鉑的殺傷作用，其阻斷作用是通過抑制細胞凋亡而實現(xiàn)的，而且特異性酪氨酸激酶抑制劑K252a能阻斷TrKB-BDNF通路，使SY5Y細胞恢復對化療藥順鉑的敏感性，進而殺傷腫瘤細胞[6]。

本實驗中我們先用納摩爾濃度的ATRA誘導TrKB表達，再加BDNF、MAPK抑制劑U0126、PI3K/AKT抑制劑LY294002、PLC抑制劑U73122及化療藥順鉑，檢測細胞存活率及凋亡率的變化。實驗結(jié)果表明，TrKB-BDNF信號傳導通路的激活能夠抑制順鉑對NB細胞的殺傷作用。兩兩比較結(jié)果顯示，ATRA+BDNF+CDDP組與對照組間細胞凋亡率差異無顯著性(P>0.05)，說明TrKB-BDNF信號傳導通路激活后可抑制順鉑對NB細胞的誘導凋亡作用，從而使NB細胞對化療藥耐藥；TrKB-BDNF信號通路的下游信號通路PI3K/AKT被阻斷后，ATRA +BDNF+LY294002+CDDP組細胞對順鉑的敏感性增加，細胞的凋亡率明顯升高，與ATRA+BDNF+CDDP組相比，差異有顯著性(P<0.05),說明PI3K/AKT通路被阻斷后，順鉑的誘導凋亡作用得以恢復；TrKB-BDNF信號通路的下游信號通路PLC被阻斷后，ATRA +BDNF+U73122+CDDP組細胞的凋亡率與ATRA+BDNF+CDDP組相比，差異無顯著性(P>0.05),說明PLC通路被阻斷后，SH-SY5Y細胞對化療藥順鉑的敏感性未受影響；TrKB-BDNF信號通路的下游信號通路MAPK被阻斷后，ATRA +BDNF+U0126+CDDP組細胞的凋亡率與ATRA+BDNF+CDDP組相比，差異無顯著性(P>0.05),說明MAPK通路被阻斷后，SH-SY5Y細胞對化療藥順鉑的敏感性亦未受影響。以上結(jié)果說明TrKB-BDNF信號傳導通路的下游PI3K/AKT信號傳導通路可能參與NB細胞的增殖及化療耐藥，阻斷該下游信號傳導通路可逆轉(zhuǎn)NB細胞耐藥，恢復對化療藥順鉑的敏感性，而MAPK和PLC信號傳導通路對NB的化療敏感性無影響。

綜上所述，TrKB-BDNF信號傳導通路的激活可能導致NB患者的不良預后，TrKB-BDNF信號傳導通路已成為抗腫瘤治療的新靶點，另外治療目標可選擇該通路的下游信號通路中的關(guān)鍵細胞間調(diào)節(jié)分子，如PI3K抑制劑等[7]。TrKB-BDNF信號傳導通路作為抗腫瘤治療的新靶點，其確切機制還需要進一步深入地研究，為臨床治療提供新的理論依據(jù)。

[1] Nevo I, Sagi-Assif O, Edry Botzer L, et al.Generation and characterization of novel local and metastatic human neuroblastoma variants[J].Neoplasia, 2008 ,10(8):816-27.

[2] D'Angelo B, Benedetti E, Di Loreto S,et al.Signal transduction pathways involved in PPARβ/δ-induced neuronal differentiation[J].J Cell Physiol,2011,226(8):2170-80.

[3] Z Li,J Zhang,Z Liu,C-W Woo and CJ Thiele.Downregulation of Bim by brain-derived neurotrophic factor activation of TrKB protects neuroblastoma cells from paclitaxel but not etoposide or cisplatin-induced cell death[J].Cell death and differentiation, 2007, 14:318-326.

[4] Evangelopoulos ME, Weis J, Kruttgen A.Neurotrophin effects on neuroblastoma cells: correlation with trk and p75NTR expression and influence of Trk receptor bodies[J].J Neurooncol,2004,66(1-2):101-110.

[5] Fung W, Hasan MY, Loh AH,et al.Gene expression of TRK neurotrophin receptors in advanced neuroblastomas in Singapore--a pilot study[J].Pediatr Hematol Oncol,2011,28(7):571-578.

[6] 李愛敏,李坤霞,張繼紅.TrKB-BDNF信號通路對神經(jīng)母細胞瘤細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子的影響[J].中國當代兒科雜志,2011,13：3.

[7] Sun W, Modak S.Emerging treatment options for the treatment of neuroblastoma: potential role of perifosine[J].Onco Targets Ther, 2012,5:21-29.