王天玉 張偉清 陳偉

（浙江省柑橘研究所 臺州黃巖318026）

水果中有機酸的分析方法研究進展

王天玉 張偉清 陳偉

（浙江省柑橘研究所 臺州黃巖318026）

水果中常見的有機酸有檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、乙酸、丁二酸和草酸等，是果實中主要的風味營養(yǎng)物質(zhì)，可軟化血管，促進鈣、鐵元素的吸收，能刺激消化腺的分泌活動，有增進食欲、幫助消化吸收及止渴解暑的功能，是果品成熟度、儲藏性以及加工性的重要依據(jù)，其種類和含量與果品品質(zhì)有密切關(guān)系，因此研究水果中有機酸的組成和含量，在果品品質(zhì)鑒定中占有重要地位[1,2]。由于有機酸種類較多，易溶于水或乙醇，難溶于其它的有機溶劑。目前，關(guān)于有機酸的提取和檢測方法較多，有水提取法[3～4]、衍生化法[5]、滴定法[6～7]、分光光度法[8]、GC[9～10]、HPLC/HPLC-MS[11～14]等，通過對這些方法的總結(jié)和對比，可更好的為不同水果中有機酸的分析方法研究提供參考依據(jù)。

1 樣品前處理方法

1.1 提取方法

有機酸主要是含有羧基(-COOH)、磺酸(-SO3H)、亞磺酸(RSOOH)、硫羧酸(RCOSH)等一類的化合物，與水和強極性的溶劑有很好的溶解性，因此，大多數(shù)采用水和醇類提取。劉文靜等[15]稱取一定量的楊梅勻漿基質(zhì)，加入蒸餾水旋渦振蕩2min，超聲提取15min處理；郭根和等[2]在枇杷果肉的勻漿液中加入一定量 0.04moL· L-1KHPO-HPO，pH為

2333

2.4 的緩沖液，75℃水浴加熱浸提45min，冷卻至室溫，旋渦振蕩2min，超聲提取15min，過濾；龐新安等[3]對巴旦杏、無花果、沙棗、石榴采用80%乙醇勻漿提取 5min處理，均取得較好的回收率；沈宏等[16]將番茄勻漿，加入適量的蒸餾水，在75℃水浴中提取15min；王瑞琪等[17]在煙草粉末中加入蒸餾水，壓力為10.3Mpa，溫度60℃，靜態(tài)時間6min，沖洗體積150%，吹掃時間100 s，靜態(tài)循環(huán) 1次的條件下加速溶劑萃取其中的有機酸。

1.2 凈化方法

對于不同的樣品要采取不同的凈化方法。目前使用最多的凈化方法為液液萃取和固相萃取兩種。郭燕等在測定蘋果中有機酸的過程中，經(jīng)過蒸餾水超聲提取后，在10000r/min離心15min和過C18固相萃取小柱(先用2mL甲醇活化，再用5mL水洗去甲醇)，取 5mL試液，以10mL/min流速通過預活化的固相萃取小柱，棄去初始的 2mL濾液，收集后續(xù) 3mL濾液，用0.45 μ m濾膜過濾[4,18]，均有較好的回收率；高蕓等[5]有機酸衍生化反應后通過二氯甲烷液液分配凈化后，采用氣相色譜測定；藏祥韻等[19]將水果中的有機酸經(jīng)過乙醇提取后，濾液通過DEAE纖維素交換柱(柱長20cm、內(nèi)徑 1cm裝約15mL的DEAE纖維素)，先用50mL無離子水洗去糖分及其它雜質(zhì)，再用70mL 0.1N Na2SO4溶液洗脫有機酸。

1.3 衍生化方法

有機酸難溶于有機溶劑，具有一定的酸性，為了能夠用于氣相色譜檢測，需要發(fā)生衍生化反應，生成沸點低，易于氣化的酯化

物質(zhì)，但存在方法比較繁瑣，反應過程不充分等問題。曾有報道，獼猴桃樣品提取液中加入10%H2SO4-CH3OH溶液，低速機械振蕩30min，放置過夜進行衍生化反應[5,20]；杜曦等[21]測定了葡萄酒中的多元有機酸，樣品于蒸發(fā)皿中，用0.1mol/L的四甲基氫氧化銨中和至pH為8，水浴蒸干，冷至室溫，以N,N-二甲基甲酰胺分次溶解剩余有機酸鹽，溶液轉(zhuǎn)移入試管中，逐滴加入一定量碘乙烷，緊塞，搖勻，放置30min后在選定實驗條件下進樣分析。

2 測定方法

2.1 液相色譜(HPLC))方法

由于有機酸易溶于水，一般選擇液相色譜法進行檢測。有機酸大多數(shù)都有紫外吸收，故選用紫外檢測器，同時該類化合物在C18柱上面都能取得較好的分離效果，選取不同的流動相可以滿足不同的需求。劉文靜[15]等對楊梅果實中的10種有機酸進行液相色譜測定，流動相：0.04mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液，pH值2.4；流速：0.8mL/min；柱溫：35℃；進樣量10uL；檢測波長：214nm，得到有效分離；黃桂穎等[22]測定了荔枝肉中草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、富馬酸、檸檬酸、琥珀酸10種有機酸，采用0.01mol/L（NH4）2HPO4（pH 3.0）溶液作為流動相，流速為1.00mL/ min，檢測波長為213nm；陳向明等在流動相為3%甲醇- 0.01mol/L K2HPO4溶液，用磷酸調(diào)節(jié) pH為2.0，流速為0.5mL/min，進檢測波長為210nm的條件下測定銀杏果中7種有機酸的含量，檢出限在 0.001～ 0.067 μg/mL之間；另外一種采用離子排斥色譜法測定水果中的有機酸，其為高容量的樹脂，電離組分受排斥不被保留，而弱酸則有一定保留的原理，即分離機理為離子排斥。郭燕等[4]采用光電二極管陣列檢測器測定蘋果中檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等幾種有機酸，檢測波長為210nm，流動相為0.01mol/L H2SO4溶液，流速為 0.5mL/min，色譜柱為ICPAKTMION Exclusion(WAT010290)，取得較好的分析效果；郭德華等[23]采用離子排斥色譜法同時測定果汁中11種有機酸，流動相也為 H2SO4。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS))分析法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機是使用合適的接口技術(shù)將液相色譜和質(zhì)譜儀聯(lián)結(jié)起來的一種大型儀器，不僅檢測靈敏度高、選擇性好，并且可以定性、定量檢測同時進行，對于初級監(jiān)測呈陽性反映的樣品進行在線確證，優(yōu)勢十分明顯。

王乃平等采用液質(zhì)聯(lián)用法測定廣山楂有機酸含量色譜柱為Kinetex HILIC100 A ( 4.60 mm×100 mm，2.6 μm)，流動相為乙腈-乙酸銨水溶液(30∶70)，流速0.5mL/min，進樣量 0.5 μ L，質(zhì)譜條件為ESI離子源，檢測方式為MRM多重反應監(jiān)測，負離子模式，干燥氣溫度35℃，霧化器壓力40Psi，干燥氣流速10L/min，掃描方式選擇離子監(jiān)測(SIM)，結(jié)果顯示，蘋果酸、檸檬酸、酒石酸 3種有機酸回收率分別為103.07%(RSD 3.85%)，99.51% (RSD 4.12%)，85.03%(RSD 4.39%)。

2.3 氣相色譜（GC）方法

氣相色譜法(GC法)是采用氣體作流動相，待測組分通過色譜柱，利用物質(zhì)在兩相中的反復分配，最后實現(xiàn)組分的分離和檢測，它分析的對象是氣體以及可揮發(fā)的物質(zhì)。常用的色譜柱有填充柱、毛細管柱兩大類，檢測器一般有ECD、FPD、FID、NPD、TCD等。

對于有機酸酯化后的衍生物，其中主要集中在FID的檢測[5,21,24]，高蕓等對獼猴桃中的有機酸進行衍生化后，采用氣相色譜法測定，在DB- 5毛細管柱，進樣口溫度250℃，檢測器溫度280℃，升溫程序：初始溫度40℃，保持 2min，以8℃/min升至250℃，保持 6min的色譜條件下取得良好的分離和較高的回收率。

2.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS))分析法

GC-MS聯(lián)用儀分析農(nóng)藥最初是以電子轟擊離子定性，選擇離子檢測定量開始的，當高靈敏度的離子阱質(zhì)譜儀出現(xiàn)以后，GC-CI-MS方法已成為農(nóng)藥殘留分析的常規(guī)手段。氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)既發(fā)揮了色譜法的高分離能力，又發(fā)揮了質(zhì)譜法的高鑒別能力，尤其適用于多殘留分析，現(xiàn)已經(jīng)成為一種相對成熟的檢測手段。

目前對于有機酸的檢測大多采用EI源[20,25]，如梁茂雨等采用此方法測定紅提葡萄中有機酸，樣品經(jīng)過硫酸甲醇酯化后，選取彈性石英毛細管柱HP-Innowax，程序升溫：初溫 50℃，保持2min，以4℃/min升至220℃，保持15min。 進樣口溫度250℃，進樣量1.0 μ L，分流比10∶1，氦氣流速1mL/ min；EI源電子能量70Ev,電子倍增器電壓1600 V，質(zhì)量掃描范圍30AMU～550 AMU，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，可測得17種有機酸。

3 結(jié)語

果實中有機酸是決定果實風味品質(zhì)的重要因素之一。對有機酸成分檢測技術(shù)的不斷更新能夠更好地為有機酸在水果中的調(diào)控提供更準確的數(shù)據(jù)，它在果實自身代謝中參與了光合作用、呼吸作用，以及合成酚類、氨基酸、酯類和芳香物質(zhì)的代謝過程。通過有機酸成分檢測方法的分析和評述，為有機酸方面的研究提供更好的依據(jù)。

[ 1]王常糯.天然果汁的分析現(xiàn)狀[J].云南大學學報.1999,21(S 2):110～111

[ 2]郭根和,潘成,蘇德森等.反相高效液相色譜法同時測定批把中的某些有機酸[J].福建農(nóng)業(yè)學報.2005,20( 3):198～201

[ 3]龐新安,萬英.果品中有機酸提取方法比較研究[J].食品研究與開發(fā).2007,28(12):126～128

[ 4]郭燕,梁俊,李敏敏,等.高效液相色譜法測定蘋果果實中的有機酸.食品科學.2012,33(02): 227～230

[ 5]高蕓,朱曉蘭,楊俊,等.毛細管氣相色譜法分析獼猴桃中的有機酸.食品科學.2007,28 (01):273～275

[ 6]雷成康,郭玲.山楂中有機酸含量測定方法的改進[J].中藥材,2010,33( 5):745～747

[ 7]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京:化學工業(yè)出版社.2005:22,54

[ 8]黃志先,戴仁澤.螢光分光光度法定量測定葡萄酒中蘋果酸含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè).1985 ( 6):26

[ 9]朱曉蘭,高蕓,蘇慶德.毛細管氣相色譜法測定番茄中的非揮發(fā)性有機酸、高級脂肪酸和低分子量糖類[J].食品科學.2004,25( 9):152～157

[10]陳飛欽,曾千春,宋春滿,等.超聲波提取～氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析煙葉中揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機酸[J].分析科學學報.2011,27( 1):35～39

[11]張麗麗,劉威生.高效液相色譜法測定 5個杏品種的糖和酸[J].果樹學報.2010,27( 1):119～123

[12]趙景嬋,郭治安,常建華,等.有機酸類化合物的反相高效液相色譜法的分離條件研究[J].色譜,2001,19( 3):260～263

[13]崔雨林,戴蘊青,韓雅珊.高效液相色譜法測定水果及其果汁中的幾種有機酸[J].北京農(nóng)業(yè)大學學報,1995,21( 1):39～43

[14]王乃平,袁艷,江海燕,等.液質(zhì)聯(lián)用法測定廣山楂有機酸含量[J].中國實驗方劑學雜志, 2011,17(10):77～78

[15]劉文靜,潘葳.采用反相高效液相色譜法同時測定楊梅果實中的有機酸[J].熱帶作物學報2011,32( 1):172～175

[16]沈宏,嚴小龍,鄭少玲,等.菜豆有機酸和無機陰離子同時分析的離子色譜法[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報,2001,22( 2):8～10

[17]王瑞琪,王娜妮,朱巖.加速溶劑萃取離子色譜法測定煙草中無機陰離子和有機酸[J].浙江大學學報，2012,39( 2):205～209

[18]李云康,潘思軼.高效液相色譜法測定柑橘汁糖的組成[J].食品科學.2006,27( 4):190～192

[19]藏祥韻,衣純真,嚴精祿,等.氣相色譜法測定水果蔬菜中的有機酸[J].北京農(nóng)業(yè)大學學報.1989,15( 1):51～55

[20]梁茂雨,劉鋼湖.紅提葡萄中有機酸成分的GC～MS分析[J].食品研究與開發(fā).2007,28(10): 126～128

[21]杜曦,周錫蘭,余錄等.衍生化氣相色譜法測定葡萄酒中多元有機酸[J].西南民族大學學報, 2007,33( 6):1365～1368

[22]黃桂穎,白衛(wèi)東,楊幼慧等.反相高效液相色譜法測定荔枝肉中10種有機酸[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25( 5):568～570

[23]郭德華,夏琳.離子排斥色譜法同時測定果汁中11種有機酸[J].色譜,2001,19( 3):276～278

[24]張峻松,賈春曉,張文葉等.山楂中有機酸的定量分析研究[J].中州大學學報,2003,20( 3): 119～121

[25]賈春曉,毛多斌,趙瑪?shù)?氣相色譜-質(zhì)譜法分析山楂果中的有機酸[J].化學研究與應用, 2004,16( 3):435～439

2012-11-14