黃彥欽 沈虹 李墨丹 袁瑛

微衛(wèi)不穩(wěn)定(microsatellite instbility，MSI)又稱復(fù)制錯誤(replication error，RER)，其意義是腫瘤細(xì)胞與同一個體的正常組織細(xì)胞DNA相比，腫瘤細(xì)胞的基因組DNA中單個、二個、三個或四個核苷酸組成的重復(fù)序列長度發(fā)生了改變［1-2］。最初的研究認(rèn)為，MSI是遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)特征性的分子變化，與人類錯配修復(fù)基因(mismatch repair，MMR)的種系突變有關(guān)。而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)一小部分的散發(fā)性大腸癌也存在著MSI現(xiàn)象，但這種MSI大都與hMLH1基因的啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)有關(guān)。

目前有兩種方法明確腫瘤的MSI狀態(tài)。一種是RER試驗，即設(shè)計引物通過PCR的方法擴增微衛(wèi)星位點，常用的檢測位點是美國國家癌癥研究所(NCI)專家推薦的5個標(biāo)準(zhǔn)位點(BAT26、BAT25、D2S123、D5S346 和 D17S250)。通過正常組織和腫瘤組織的比較，如果2個以上位點存在MSI狀態(tài)則認(rèn)為該患者是高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-high，MSI-H)，即錯配修復(fù)功能缺陷(defective MMR，dMMR);如果小于2個位點存在MSI狀態(tài)或無一位點存在MSI狀態(tài)，則認(rèn)為該患者是低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-low，MSI-L)或微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability，MSS)，即錯配修復(fù)功能完整(proficient MMR，pMMR)。除NCI專家推薦的這五個位點，也可擴增Sargent等［3］推薦的11個微衛(wèi)星位點，如大于30%的位點陽性則患者為MSI-H，如小于30%的位點陽性則患者為MSI-L，所有位點都陰性則患者為MSS。此方法對實驗室要求較高，很難在基層醫(yī)院開展。另一種MSI的檢測方法是采用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemical staining，IHC)檢測腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6和hPMS2蛋白的表達，如這四個蛋白均陽性表達，說明該患者為pMMR狀態(tài);如這四個蛋白中任一蛋白為陰性表達，則患者為dMMR狀態(tài)。此方法相對簡單易行，對實驗室要求較低，成本也較低，容易在基層醫(yī)院的病理科開展實施。

美國癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)的結(jié)直腸癌指南中明確指出小于50歲的患者和所有的II期結(jié)直腸癌患者在術(shù)后選擇輔助化療前，均需明確腫瘤的MSI狀態(tài)。筆者就從這兩個方面對MSI因素在結(jié)直腸癌患者中的臨床意義做一闡述。

一、檢測MSI狀態(tài)明確小于50歲結(jié)直腸癌患者的遺傳背景

已有研究表明約三分之一結(jié)直腸癌的發(fā)生與遺傳相關(guān)，這其中又以HNPCC最為常見，約占所有結(jié)直腸癌的1% ～5%。MSI現(xiàn)象是HNPCC的一個重要特征。錯配修復(fù)基因遺傳性缺陷是HNPCC的病因，而MSI現(xiàn)象正是這些錯配修復(fù)基因缺陷在基因組上的表現(xiàn)。但是，并不是所有MSI結(jié)直腸癌都是HNPCC。有MSI表現(xiàn)的結(jié)直腸癌約占所有結(jié)直腸癌的15%，而HNPCC只占到其中的3% ～5%，其余的10%～12%是由結(jié)直腸癌體細(xì)胞hMLH1基因甲基化導(dǎo)致的［4］。同樣，并不是有明顯家族聚集現(xiàn)象的結(jié)直腸癌都會有MSI表現(xiàn)。臨床上與HNPCC完全相符的家族聚集性結(jié)直腸癌無MSI表現(xiàn)者可達20%以上，這種家族聚集結(jié)直腸癌被稱作癌家族X綜合癥［5］。因此，可以說MSI表現(xiàn)與HNPCC是同一原因引起的兩種不同表象。

從理論上講，MSI因素可能包含著HNPCC的發(fā)病機制。MMR基因缺陷導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，DNA在復(fù)制過程中錯配概率增加，突變積累，最后引發(fā)癌癥。這是一個看上去比較合理的假設(shè)。但是，我們在HNPCC腫瘤組織上發(fā)現(xiàn)的MSI狀態(tài)絕大部分并不在基因的外顯子區(qū)域，而往往在內(nèi)含子區(qū)或基因之間的區(qū)域。1997年NCI專家制定了判定MSI狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)，即將 BAT25，BAT26，D5S346，D2S123，D17S150 等 5個微衛(wèi)星位點作為不穩(wěn)定程度的標(biāo)準(zhǔn)［6］，有2個及2個以上位點不穩(wěn)定者為MSI-H，但這些位點并不在基因的重要區(qū)域。目前已知的HNPCC相關(guān)MSI位點中，體細(xì)胞TGFBRII基因上的MSI位點可能與結(jié)直腸癌發(fā)病機制密切相關(guān)［7］，遺傳性TGFBRI基因6A微衛(wèi)星序列可能與結(jié)直腸癌易感性相關(guān)，但這方面的研究尚未有進一步突破。

MSI和HNPCC均由MMR基因缺陷引起，但不同的MMR基因或不同的MMR基因突變方式引起的結(jié)直腸癌似乎并不相同。MMR基因在人類基因組中多達12個，但目前已知與HNPCC的發(fā)生有關(guān)的僅有4個(hMLH1，hMSH2，hMSH6和hPMS2)。最近，有專家認(rèn)為一個與hMSH2相關(guān)的EPCAM基因突變可能也是HNPCC的致病因素［8］。這些基因遺傳性突變的頻率和產(chǎn)生腫瘤的類型均有不同，hMSH2和hMLH1占到所有突變的90%以上，其產(chǎn)生的腫瘤大多為結(jié)直腸癌，hMSH6突變約占6%，其突變者中子宮內(nèi)膜癌患病率明顯高于其他基因突變者［9］。同樣是hMLH1基因變異的結(jié)直腸癌，hMLH1啟動子甲基化引起者與hMLH1遺傳性突變者的結(jié)直腸癌生物學(xué)特性也存在差異，前者對5-氟尿嘧啶的化療不敏感，而后者則相對較敏感［10］。在這些MMR基因突變的結(jié)直腸癌中，MSI表現(xiàn)則較為一致，BAT25、BAT26等單核苷酸重復(fù)序列的不穩(wěn)定仍然是最常見的MSI現(xiàn)象。

由于幾乎所有已證實存在MMR基因突變的HNPCC組織中均存在MSI現(xiàn)象，因此對所有臨床確診的結(jié)直腸癌患者檢測MSI狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)MSI-H者在排除hMLH1甲基化的原因后同時檢測患者外周血中MMR基因的遺傳性突變，可篩選出HNPCC患者，但單獨采用檢測MSI狀態(tài)方法篩選HNPCC患者可能不是一種經(jīng)濟的方法［11］。結(jié)直腸癌組織MMR蛋白的IHC檢測也有相同的作用［12］，將MSI檢測與IHC檢測聯(lián)合應(yīng)用則有較好的成本效果比［11］。在利用檢測MSI狀態(tài)方法篩選HNPCC的過程中，當(dāng)篩查發(fā)現(xiàn)MSI-H者，還需將遺傳突變引起的MSI狀態(tài)與體細(xì)胞hMLH1基因突變引起的MSI狀態(tài)做鑒別，此時用BRAF基因上V600E突變位點做排除篩選是一個非常有效的方法，因為凡是有BRAF基因突變者均不是HNPCC。應(yīng)用上述方法對所有結(jié)直腸癌患者進行篩查，可發(fā)現(xiàn)其中3．6%的患者為 HNPCC［13］。由于 MSI-H結(jié)直腸癌的發(fā)病年齡較早，椐 Mecklin等［14］的報導(dǎo)，在HNPCC家系表中中，80%的大腸腫瘤發(fā)生在50歲以前，12%發(fā)生在39歲以下，而1%發(fā)生在70歲以上，因此，推薦對發(fā)病年齡小于50歲的患者常規(guī)進行MSI的檢測，以明確其遺傳背景。

二、檢測MSI狀態(tài)指導(dǎo)II期結(jié)直腸癌患者術(shù)后的輔助治療

對于散發(fā)性結(jié)直腸癌而言，MSI狀態(tài)首先是一個預(yù)后相關(guān)標(biāo)記。大量回顧性研究的結(jié)果提示，無論是在II期患者還是III期結(jié)直腸癌患者中，MSI-H的錯配修復(fù)功能缺陷(dMMR)的結(jié)直腸癌患者往往能夠獲得更好的預(yù)后［15-19］。2005年發(fā)表在JCO上的一項薈萃分析結(jié)果也證實了這一觀點［20］。Sargent等［3］對507 例患者進行了 MSI狀態(tài)檢測，發(fā)現(xiàn)II期結(jié)直腸癌組織分化程度差患者中dMMR比例明顯高于其他類型。單因素分析的結(jié)果顯示，在只接受手術(shù)治療而未行術(shù)后輔助化療的患者中，dMMR(MSI-H)組的無復(fù)發(fā)生存(disease-free survival，DFS)明顯優(yōu)于pMMR組，這些結(jié)果提示MSI狀態(tài)對患者而言是一項有意義的預(yù)后因素。雖然這一結(jié)論尚未被多因素分析所證實，但在單因素分析中較高的HR值仍提示其對患者的預(yù)后起到了較強的保護作用。研究提示這種保護作用可能與MSI-H狀態(tài)下腫瘤VEGF表達水平及微血管密度有關(guān)［21-22］。

MSI狀態(tài)除了能夠作為結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存的預(yù)后因子外，研究還顯示MSI狀態(tài)對5-氟尿嘧啶在結(jié)直腸癌患者中的療效預(yù)測上也存在著一定的意義。20世紀(jì)90年代起，以5氟尿嘧啶(5-FU)和亞葉酸鈣為主的化療方案成為了III期大腸癌患者以及部分II期高危大腸癌患者的術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)輔助化療方案［23-26］。目前，國際上關(guān)于III期大腸癌患者常規(guī)接受含5-氟尿嘧啶類藥物的方案化療已經(jīng)達成共識。然而，是否應(yīng)該對II期大腸癌進行術(shù)后常規(guī)輔助化療仍然存在爭議。部分臨床試驗的結(jié)果顯示，在接受輔助化療的II期大腸癌患者中只有約3%的患者生存期得到了提高［27-28］，而從已有的研究結(jié)果來看，這些患者似乎并未從含5-氟尿嘧啶的化療方案中獲益。也正因為如此，2004年美國臨床腫瘤學(xué)會提出:不推薦在II期結(jié)腸癌患者中進行常規(guī)術(shù)后輔助化療。

由于II期大腸癌具有與其他期結(jié)直腸癌所不同的臨床特征和分子表現(xiàn)(MMR缺失和MSI高發(fā)生率)，人們開始關(guān)注5-氟尿嘧啶療效是否與II期大腸癌與眾不同的分子特征存在關(guān)聯(lián)性。Ribic等［29］首先提出了dMMR的腫瘤無法從5-氟尿嘧啶化療中獲益的假說。目前許多關(guān)于MMR與化療療效的研究結(jié)果也支持這一觀點。一項體外實驗的結(jié)果顯示，hMLH1缺失的細(xì)胞系會對5-氟尿嘧啶產(chǎn)生抗藥性，這一抗藥性通常是由hMLH1啟動子甲基化所引起的。實驗同時也提示hMLH1缺失狀態(tài)可以被去甲基物質(zhì)5氮胞苷所逆轉(zhuǎn)。而另一項異種移植實驗也證實了伴MSI現(xiàn)象的大腸癌存在對5-氟尿嘧啶的抗藥性［29］。Sargent等對457例結(jié)直腸癌患者進行MSI狀態(tài)檢測及隨訪后發(fā)現(xiàn)，無論術(shù)后病理分期是II期還是III期，接受5-氟尿嘧啶化療并不能改善dMMR患者的DFS和OS，尤其對于dMMR的II期大腸癌患者而言，5-氟尿嘧啶輔助化療反而會降低OS。

由于dMMR結(jié)直腸癌患者相對pMMR患者預(yù)后相對更佳，因此dMMR患者不接受術(shù)后輔助化療也是一種可選擇的治療策略。美國胃腸協(xié)作組正在進行的E5202試驗，將II期結(jié)直腸癌患者按照手術(shù)前MSI狀態(tài)以及染色體18q的雜合性缺失情況分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組進行輔助化療或觀察隨訪，這個研究結(jié)果將進一步明確MSI及18qLOH對II期腸癌預(yù)后的影響［30］。而由于dMMR或MSI-H狀態(tài)的II期結(jié)直腸癌并不能夠從5-FU的術(shù)后化療中獲益，因此不推薦對這些患者進行5-FU的術(shù)后化療，這樣也可以避免治療相關(guān)的毒性、花費以及化療所引起的生活質(zhì)量的下降。值得注意的是，雖然在Sargent等人的研究中提示pMMR狀態(tài)的II期結(jié)直腸癌患者在接受了5-氟尿嘧啶化療后在DFS和OS上均有獲益，但現(xiàn)有的證據(jù)并不支持將pMMR作為II期患者術(shù)后輔助化療的高危因素。目前公認(rèn)的臨床高危因素仍是腫瘤分期為T4、穿孔、腸梗阻、腫瘤分化程度差、存在血管浸潤及清掃淋巴結(jié)數(shù)目小于12枚［31］。

［1］ Aaltonen LA，Peltomaki P，Leach FS，et al．Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer．Science，1993，260(5109):812-816．

［2］ Ionov Y，Peinado MA，Malkhosyan S，et al．Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis．Nature，1993，363(6429):558-561．

［3］ Sargent DJ，Marsoni S，Monges G，et al．Defective mismatch repair as a predictive marker for lack of efficacy of fluorouracil-based adjuvant therapy in colon cancer．J Clin Oncol，2010，28(20):3219-3226．

［4］ Chapelle A，Hampel H．Clinical relevance of microsatellite instability in colorectal cancer．J Clin Oncol，2010，28(20):3380-3387．

［5］ Lindor NM，Rabe K，Petersen GM，et al．Lower cancer incidence in Amsterdam-I criteria families without mismatch repair deficiency:familial colorectal cancer type X．JAMA，2005，293(16):1979-1985．

［6］ Boland CR，Thibodeau SN，Hamilton SR，et al．A National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer detection and familial predisposition:development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer．Cancer Res，1998，58(22):5248-5257．

［7］ Markowitz S，Wang J，Myeroff L，et al．Inactivation of the type II TGF-beta receptor in colon cancer cells with microsatellite instability．Science，1995，268(5215):1336-1338．

［8］ Kempers MJ，Kuiper RP，Ockeloen CW，et al．Risk of colorectal and endometrial cancers in EPCAM deletion-positive Lynch syndrome:a cohort study．Lancet Oncol，2011，12(1):49-55．

［9］ Baglietto L，Lindor NM，Dowty JG，et al．Risks of Lynch syndrome cancers for MSH6 mutation carriers．JNatl Cancer Inst，2010，102(3):193-201．

［10］ Sinicrope FA，F(xiàn)oster NR，Thibodeau SN，et al．DNA mismatch repair status and colon cancer recurrence and survival in clinical trials of 5-fluorouracil-based adjuvant therapy．JNatl Cancer Inst，2011，103(11):863-875．

［11］ Mvundura M，Grosse SD，Hampel H，et al．The cost-effectiveness of genetic testing strategies for Lynch syndrome among newly diagnosed patients with colorectal cancer．Genet Med，2010，12(2):93-104．

［12］ Hampel H，F(xiàn)rankel WL，Martin E，et al．Screening for the Lynch syndrome(hereditary nonpolyposis colorectal cancer)．N Engl J Med，2005，352(18):1851-1860．

［13］ Hampel H，F(xiàn)rankel WL，Martin E，et al．Feasibility of screening for Lynch syndrome among patients with colorectal cancer．J Clin Oncol，2008，26(35):5783-5788．

［14］ Mecklin JP，Jarvinen HJ，Peltokallio P．Cancer family syndrome．Genetic analysis of 22 Finnish kindreds．Gastroenterology，1986，90(2):328-333．

［15］ Thibodeau SN，Bren G，Schaid D．Microsatellite instability in cancer of the proximal colon．Science，1993，260(5109):816-819．

［16］ Lothe RA，Peltomaki P，Meling GI，et al．Genomic instability in colorectal cancer:relationship to clinicopathological variables and family history．Cancer Res，1993，53(24):5849-5852．

［17］ Gryfe R，Kim H，Hsieh ET，et al．Tumor microsatellite instability and clinical outcome in young patients with colorectal cancer．N Engl JMed，2000，342(2):69-77．

［18］ Halling KC，F(xiàn)rench AJ，McDonnell SK，et al．Microsatellite instability and 8p allelic imbalance in stage B2 and C colorectal cancers．JNatl Cancer Inst，1999，91(15):1295-1303．

［19］ Kakar S，Aksoy S，Burgart LJ，et al．Mucinous carcinoma of the colon:correlation of loss of mismatch repair enzymes with clinicopathologic features and survival．Mod Pathol，2004，17(6):696-700．

［20］ Popat S，Hubner R，Houlston RS．Systematic review of microsatellite instability and colorectal cancer prognosis．J Clin Oncol，2005，23(3):609-618．

［21］ Wynte CVA．Angiogenic factor VEGF is decreased in human colorectal neoplasms showing DNA microsatellite instability．The Journal of Pathology，1999，189(3):319-325．

［22］ Wendum D，Boelle PY，Rigau V，et al．Mucinous colon carcinomas with microsatellite instability have a lower microvessel density and lower vascular endothelial growth factor expression．Virchows Arch，2003，442(2):111-117．

［23］ Moertel CG，F(xiàn)leming TR，Macdonald JS，et al．Levamisole and fluorouracil for adjuvant therapy of resected colon carcinoma．N Engl J Med，1990，322(6):352-358．

［24］ Wolmark N，Rockette H，Mamounas E，et al．Clinical trial to assess the relative efficacy of fluorouracil and leucovorin，fluorouracil and levamisole，and fluorouracil，leucovorin，and levamisole in patients with Dukes'B and C carcinoma of the colon:results from National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project C-04．JClin Oncol，1999，17(11):3553-3559．

［25］ Wolmark N，Rockette H，F(xiàn)isher B，et al．The benefit of leucovorin-modulated fluorouracil as postoperative adjuvant therapy for primary colon cancer:results from National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project protocol C-03．J Clin Oncol，1993，11(10):1879-1887．

［26］ O'Connell MJ，Laurie JA，Kahn M，et al．Prospectively randomized trial of postoperative adjuvant chemotherapy in patients with highrisk colon cancer．J Clin Oncol，1998，16(1):295-300．

［27］ Gray R．QUASAR:A randomized study of adjuvant chemotherapy(CT)vs observation including 3238 colorectal cancer patients．Journal of Clinical Onccology，2004:a3501．

［28］ Sargent DJ．Confirmation of deficient mismatch repair(dMMR)as a predictive marker for lack of benefit from 5-FU based chemotherapy in stage II and III colon cancer(CC):A pooled molecular reanalysis of randomized chemotherapy trials．Journal of Clinical Oncology，2008，26(15S):a4008．

［29］ Arnold CN，Goel A，Boland CR．Role of hMLH1 promoter hypermethylation in drug resistance to 5-fluorouracil in colorectal cancer cell lines．Int JCancer，2003，106(1):66-73．

［30］ Pocard M，Bras-Goncalves R，Hamelin R，et al．Response to 5-fluorouracil of orthotopically xenografted human colon cancers with a microsatellite instability:influence of P53 status．Anticancer Res，2000，20(1A):85-90．

［31］ Benson AB，New approaches to assessing and treating early-stage colon and rectal cancers:cooperative group strategies for assessing optimal approaches in early-stage disease．Clin Cancer Res，2007，13(22):6913-6920．

袁瑛，黃彥欽，沈虹，等．結(jié)直腸癌中微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測的臨床意義［J/CD］．中華結(jié)直腸疾病電子雜志，2013，2(4):177-179．