申曉娜 趙雁林 肖和平

結(jié)核分枝桿菌（Mtb）藥物敏感性（簡稱“藥敏”）檢測是耐藥結(jié)核病診斷和治療的關(guān)鍵，主要有表型檢測法和基因型檢測法兩大類。盡管近年來分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，新的實驗診斷技術(shù)不斷出現(xiàn)，但常規(guī)細菌學(xué)表型檢測由于其客觀性、直觀性等優(yōu)點，仍是目前重要的實驗診斷手段。為了在結(jié)核病防治過程中更好地運用這項技術(shù)，筆者現(xiàn)就Mtb藥敏表型檢測方法及其研究進展情況綜述如下。

一、直接培養(yǎng)觀察的方法

（一）傳統(tǒng)培養(yǎng)法

Mtb藥敏試驗傳統(tǒng)培養(yǎng)法包括絕對濃度法、比例法和抗性比率法，該種方法具有生長依賴性，在得到分離菌株后需要3～4周才能獲得藥敏試驗結(jié)果，陰性結(jié)果報告時間需延長至8周。目前多采用絕對濃度法或比例法，絕對濃度法是我國各級實驗室多年來普遍沿用的方法，操作簡單，但對于細菌懸液的麥?zhǔn)蠞舛鹊闹苽浼熬航臃N量的要求非常嚴格，不同操作者存在很大的個體差異。比例法是WHO推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗方法［1］，該法采用了兩種菌液濃度（10－2g／L和10－4g／L）對菌液接種量進行了校正，最終計算的耐藥百分比更為精確。有文獻報道這兩種方法有較高的符合率，異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇兩種方法測試結(jié)果的一致率分別為96．2%、97．1%、98．7%、96．9%［2］，兩者耐藥率的差別主要與選定的藥物臨界濃度有關(guān)［3］；為了能更好地與國際接軌，便于信息交流，建議有條件的實驗室可以開展比例法藥敏試驗［4］。

（二）顯微鏡觀察法（MODS）

顯微鏡觀察藥敏檢測方法（microscopic observation drug susceptibility assay，MODS）是2000年Caviedes等［5］建立的用顯微鏡觀察液體培養(yǎng)基中Mtb的形態(tài)學(xué)進行耐藥性檢測的方法，可通過倒置顯微鏡觀察是否有Mtb索狀結(jié)構(gòu)來確定是否有Mtb生長，觀察含藥孔Mtb生長與否判斷耐藥性。文獻報道MODS與傳統(tǒng)羅氏藥敏結(jié)果相比有較高的敏感度和特異度，異煙肼、利福平及耐多藥（MDR）結(jié)核病的測定敏感度分別為88%、96%、91%；特異度分別為89%、90%、90%［6］；與 BACTECTMMGITTM960比較，異煙肼、利福平及 MDR測定符合率分別為92．9%、95．5%、97．3%［7］，鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星、阿米卡星和卷曲霉素結(jié)果符合率分別為90．21%、88．09%、93．62%、87．23%、92．34%、88．51%和86．81%；檢測敏感度分別為83．33%、85．11%、90．74%、85．71%、86．73%、76．92% 和77．08%；特 異 度 分 別 為 96．06%、92．55%、96．06%、88．19%、96．35%、91．80% 和 89．30%［8］。平均7d左 右報告結(jié)果，操作簡便且價廉，無需昂貴儀器設(shè)備，適合發(fā)展中國家和經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)，應(yīng)用前景廣闊。

（三）E－test法

E－test的藥敏試紙條為AB BIODISK公司的專利產(chǎn)品，試紙條上藥物含量從低到高覆蓋了15個連續(xù)倍比稀釋濃度，是根據(jù)瓊脂擴散法原理設(shè)計的，將不同濃度的試紙貼于種有生長不同細菌的培養(yǎng)基表面，藥物擴散形成濃度梯度，作用細菌后產(chǎn)生抑菌環(huán)，根據(jù)抑菌環(huán)位置所指試紙上的刻度可確定該藥對該菌的最低抑菌濃度（MIC）。如將試紙置于含有Mtb的瓊脂培養(yǎng)基上，根據(jù)測得MIC即可判斷Mtb耐藥情況。該方法5～10d出結(jié)果，該方法為定量檢測，結(jié)果準(zhǔn)確，快速；操作簡便，不需特殊儀器設(shè)備；可用于聯(lián)合藥敏試驗；易于標(biāo)準(zhǔn)化操作和質(zhì)量控制，但有報道顯示，與羅氏金標(biāo)準(zhǔn)比假陽性率高，符合率低，僅為48．6%［9］，且 E－test試紙條價格昂貴，難以推廣使用。

二、快速培養(yǎng)儀檢測系統(tǒng)

（一）BACTECTM460TB系統(tǒng)

BACTECTM460TB系統(tǒng)原理是通過在培養(yǎng)基加入14C標(biāo)記的底物，檢測代謝中釋放的14CO2量以判斷生長情況而得知其耐藥性，該方法較羅氏培養(yǎng)法，初分離時間大大縮短，分離陽性率有所提高；耐藥性檢測與絕對濃度法和比例法符合率達95%～100%［10］，結(jié)果可靠，檢測時間明顯縮短。對幾種一線抗結(jié)核藥物在獲得Mtb培養(yǎng)物后，再需4～8d即可得到藥敏試驗結(jié)果。由于對環(huán)境的放射性污染，目前已逐步被更加完善的BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)替代。

（二）BACTECTM MGITTM960系統(tǒng)

BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)是通過氧熄滅熒光感受器檢測分枝桿菌的有無。MGIT管底部包埋的O2敏感熒光顯示劑，正常情況下激發(fā)的熒光能被溶解于培養(yǎng)基中的O2所淬滅，當(dāng)培養(yǎng)管中有Mtb生長時O2被消耗，熒光探測器自動探測熒光顯示劑激發(fā)的熒光強度，可通過含藥的MGIT管熒光強度判定Mtb是否耐藥。有文獻報道全自動MGITTM960系統(tǒng)培養(yǎng)方法的敏感度和特異度高于羅氏培養(yǎng)法，報告時間平均縮短至6～9d［11－12］，是目前最為理想的快速 Mtb培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗檢測系統(tǒng)，已在我國各大臨床檢驗及實驗室廣泛應(yīng)用。

（三）BACTECTM9000MB系統(tǒng)

BACTECTM9000MB系統(tǒng)是采用液／固雙相系統(tǒng)，利用氧特異性的感應(yīng)器以熒光顯示耗氧量來監(jiān)測分枝桿菌生長過程中O2濃度的變化來判斷其生長情況。與BACTECTM460TB系統(tǒng)相比，以熒光顯示耗氧量替代了放射線，其臨床標(biāo)本的 Mtb分離率和BACTECTM460TB系統(tǒng)相當(dāng)［13］，與BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)相比，檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，污染率低，但時間較長，平均13．2d出結(jié)果，檢測時間雖長于BACTECTM460TB系統(tǒng)及BACTECTMMGITTM960系統(tǒng)，檢出率及培養(yǎng)時間明顯優(yōu)于傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法［14］。

（四）BacT ALERT 3D系統(tǒng)

BacT ALERT 3D系統(tǒng)利用顏色感應(yīng)器來監(jiān)測分枝桿菌生長過程中釋放的CO2，隨著CO2濃度的升高，感應(yīng)器的顏色會發(fā)生變化，可根據(jù)顏色變化的不同來判斷其生長狀況。待檢的培養(yǎng)瓶內(nèi)有微生物生長時，代謝過程中所產(chǎn)生的CO2可經(jīng)過BacT／ALERT培養(yǎng)和檢測系統(tǒng)半透膜滲透至瓶底，與固定于瓶底的Novel／CO2感應(yīng)器結(jié)合，伴隨CO2濃度的增加，pH值發(fā)生變化，顏色由綠色變?yōu)辄S色，產(chǎn)生CO2量的多少與分枝桿菌生長程度呈正相關(guān)，當(dāng)出現(xiàn)陽性培養(yǎng)瓶時，通過光電檢測得知CO2變化情況并經(jīng)計算機處理后，系統(tǒng)用報警或屏幕顯示等方式提示，在曲線圖上反映、分析、判斷陰性或陽性結(jié)果，該系統(tǒng)可在任何時間內(nèi)放入培養(yǎng)瓶，通過條碼識別允許該標(biāo)本進入系統(tǒng)，并連續(xù)跟蹤監(jiān)測。該系統(tǒng)可檢測血液和其他樣本的分枝桿菌，但無法確定是哪一種分枝桿菌，因此提示陽性報告的培養(yǎng)物要做進一步的菌種鑒定；還可測試分枝桿菌對吡嗪酰胺、利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇等的敏感度，有文獻報道，與羅氏培養(yǎng)法比較，氨基糖苷類、利福平、乙硫異煙胺、環(huán)丙沙星藥物敏感度檢測的符合率為100%，異煙肼為91．5%，吡嗪酰胺為85%，乙胺丁醇為72．4%，藥敏試驗種類對分枝桿菌檢測時間約為10d［15］，明顯快于金標(biāo)準(zhǔn)羅氏培養(yǎng)法。該系統(tǒng)是目前我國應(yīng)用各類快速微生物培養(yǎng)系統(tǒng)中使用最多的一種，但試劑的價格昂貴也是限制其推廣應(yīng)用為常規(guī)檢測的主要因素。

（五）Dio－TK快速自動比色培養(yǎng)系統(tǒng)

Dio－TK快速自動比色培養(yǎng)系統(tǒng)是一套顯示分枝桿菌和雜菌生長的圖像系統(tǒng)，它能夠通過連續(xù)的比色分析將真實的分枝桿菌生長與污染區(qū)別開來。將標(biāo)本接種于含有多種顏色指示劑的培養(yǎng)基上，當(dāng)Mtb的生長或其他菌存在時培養(yǎng)基發(fā)生不同顏色的變化，系統(tǒng)自動連續(xù)比色分析，提供描述性生長曲線，判斷其有無分枝桿菌生長，同時還可以區(qū)別雜菌污染。分離率不及羅氏培養(yǎng)法及BACTECTM460TB系統(tǒng)，藥敏結(jié)果與比例法和BACTECTM460TB系統(tǒng)有較好的一致性，報告時間為15d左右［16］。該系統(tǒng)對操作技術(shù)要求高，Dio－TK培養(yǎng)基對酸堿度（pH值）敏感，如果NaOH處理過的樣本沒有很好地中和，通過從紅色變?yōu)辄S色的顏色變化來檢測Mtb的生長就需要更長時間，且易污染，使之難以推廣使用。

三、氧化還原指示劑法

（一）Alamar blue法

Alamar blue法是通過氧化還原指示劑Alamar blue的顏色變化反應(yīng)Mtb在培養(yǎng)基中的氧化還原反應(yīng)，從而判斷其生長情況。Alamar blue為一種基于氧化還原反應(yīng)的指示劑，該指示劑帶有熒光標(biāo)記，還原后的Alamar blue可利用酶標(biāo)儀進行熒光定量檢測，應(yīng)用最多的是利用其進行化合物的活性檢測，以及評估原核和真核的細胞毒性［17－18］。1995年Yajko等［19］首次把Alamar blue應(yīng)用于微量最低抑菌濃度（MIC）檢測中，建立了 Alamar blue微孔板稀釋法（MABA）。當(dāng)Mtb生長時，指示劑可發(fā)生還原反應(yīng)，由其氧化狀態(tài)的藍色轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原狀態(tài)的粉色，阻止這種顏色變化的最低藥物濃度為MIC。Farnia等［20］在此方法的基礎(chǔ)上進行了簡化，只利用一個臨界濃度來檢測臨床菌株的耐藥情況。以羅氏比例法為金標(biāo)準(zhǔn)，利福平的敏感度和特異度均為100．0%時，異煙肼的敏感度和特異度分別為96．6%和100．0%［21］。該方法獲得結(jié)果僅需要7～10d時間，可以快速獲得定量的MIC藥敏結(jié)果，但其試劑較昂貴，難以廣泛應(yīng)用。

（二）刃天青法

刃天青與Alamar blue具有相似的結(jié)構(gòu)成分，作用原理類似，2002年P(guān)alomino等［22］把刃天青應(yīng)用于到Mtb藥敏檢測領(lǐng)域，建立了刃天青微孔板稀釋法（REMA）。本法實驗結(jié)果可以在接種7d內(nèi)獲得；Martin等［23］采用本法對乙硫異煙胺、卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星和對氨基水楊酸5種藥物的耐藥性進行了檢測，特異度均為100．0%，敏感度從96．8%到100．0%之間，其中氟喹諾酮類敏感度和特異度均達到了100．0%；與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)基的絕對濃度法比，利福平、異煙肼、乙胺丁醇、鏈霉素藥敏試驗的敏感度分別為92．3%、90．6%、92．9%、87．5%，特 異 度 分 別 為 96．0%、90．6%、94．0%、87．5%，準(zhǔn) 確 度 分 別 為 93．8%、90．6%、93．8%、87．5%［24］，實驗結(jié)果均較為理想。該指示劑價格低廉，實驗結(jié)果容易判讀，可獲得定量結(jié)果，可推廣使用。

（三）噻唑藍（MTT）法

MTT可在活細胞存在下經(jīng)氧化還原反應(yīng)生成藍色的結(jié)晶，該方法是通過分光光度計檢測藍色結(jié)晶來反映活細胞數(shù)目。MTT是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下生成藍色的結(jié)晶，死細胞不具有還原MTT的功能，結(jié)晶的生成量僅與活細胞數(shù)目成正比，溶解該結(jié)晶后，可以利用分光光度計檢測490nm處的光密度（A）值，以反映出活細胞數(shù)目。1998年 Mshana［25］將MTT用于Mtb微量 MIC快速檢測利福平的耐藥性中，建立了MTT微孔板稀釋法（TEMA）。Pontino等［26］和Ferrari等［27］采用 MTT法檢測一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，以比例法和BACTECTMMGITTM960法測定結(jié)果為考核標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示MTT法檢測鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇的藥敏結(jié)果符合率均在95%以上。Morcillo等［28］將其用于二線及一些選擇性抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測中，結(jié)果顯示，與比例法相比，除了卷曲霉素敏感度為90．9%之外，左氧氟沙星、阿米卡星、對氨基水楊酸、克拉霉素、環(huán)絲氨酸、氯法齊明、利福布丁的敏感度均在96%以上，特異度均在98%～100%之間。該方法結(jié)果在8d獲得，MTT價格低廉，易于推廣。

四、酶活性測試法

（一）硝酸鹽還原法（NRA）

NRA的原理是通過測試硝酸還原酶來判定細菌生長情況。NRA法是將培養(yǎng)基內(nèi)加入硝酸鹽，利用Mtb代謝過程中產(chǎn)生硝酸還原酶能使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，并與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)的特性來判定細菌生長情況，硝酸還原酶含量的不同顯色劑可從粉紅色變?yōu)樽霞t色到深紫紅色。有文獻報道，與BACTECTMMGITTM960比較，異煙肼、利福平敏感度分 別 為 100．0% 和 95．6%，特 異 度 分 別 為 97．0% 和100．0%，比較顯示異煙肼和利福平的檢測一致性較好［29］，對鏈霉素和乙胺丁醇的一致性較低［30］。有極少Mtb菌株為硝酸還原酶陰性，不適合使用該方法。NRA法平均10d報告結(jié)果，操作簡便，快速，不需特殊儀器設(shè)備，費用低廉，應(yīng)用前景較好。

（二）煙酸測定法

快速煙酸測定法是通過測定Mtb代謝產(chǎn)物煙酸來測定Mtb是否生長。2，4－二硝基氯苯等物質(zhì)能與煙酸發(fā)生顏色反應(yīng)，當(dāng)有Mtb生長時，產(chǎn)生的煙酸即可在管內(nèi)發(fā)生肉眼或儀器可檢測到的顏色變化。與改良羅氏培養(yǎng)法比平均提前10d左右［31］，試劑也便宜得多，并且能在各級醫(yī)院推廣。但快速煙酸測定法比較局限，只有Mtb才產(chǎn)生煙酸，僅限于檢測Mtb。近年來缺乏相關(guān)研究。

（三）Wayne法

Wayne法是基于檢測煙酰胺酶／吡嗪酰胺酶（PZase）活性來反映吡嗪酰胺的耐藥性的。PZase可將吡嗪酰胺轉(zhuǎn)化為有殺菌作用的吡嗪酰胺酸，將培養(yǎng)基中加入硫酸亞鐵氨，它能與吡嗪酰胺酸反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，通過顏色變化反應(yīng)PZase活性［32］，PZase失活則造成吡嗪酰胺耐藥，該法7d可能得到結(jié)果，但僅局限于反映吡嗪酰胺一種藥的耐藥性，較少應(yīng)用。

五、生物發(fā)光技術(shù)

（一）熒光素酶信號噬菌體法（LRP）

LRP法是利用熒光素酶在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）存在條件下可以分解的特性，同時在外加底物熒光素的作用下，可產(chǎn)生一定量的光子，通過光敏檢測器檢測光子的產(chǎn)量可反映ATP的含量，從而反映活菌情況。ATP是細菌能量代謝的指標(biāo)，生物半衰期短，當(dāng)細菌生長抑制或死亡后，胞內(nèi)ATP含量即明顯下降或消失，因而可作為活菌的標(biāo)志，用熒光素酶基因重組的噬菌體去感染Mtb，含有熒光素酶編碼基因的分枝桿菌噬菌體在Mtb體內(nèi)繁殖，并產(chǎn)生熒光素酶作用于熒光素，產(chǎn)生生物發(fā)光，通過檢測熒光信號的強弱來反映細菌生長情況。據(jù)文獻報道，該法與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法相比符合率為87%，敏感度和特異度分別為90%和81%［33］。該法可以直接用于痰標(biāo)本的藥敏檢測，無需分離菌株，72h內(nèi)可檢測出結(jié)果，簡便、準(zhǔn)確、快速，并可自動化測量，但是培養(yǎng)基易污染，易因雜菌存在造成假陽性，仍有待改進，尚不能普及。

（二）ATP生物發(fā)光法

ATP生物發(fā)光法是通過將Mtb直接裂解并提取細胞內(nèi)的ATP，通過加入生物發(fā)光試劑，并利用光度計檢測發(fā)光量測定ATP含量，通過測定含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Mtb的ATP含量的不同得到其藥敏結(jié)果。該法報告時間是3d，與比例法一致性高，重復(fù)性好，簡便，但是操作繁瑣，影響因素較多［34］，且ATP存在于所有細胞中，故該法特異度較差。

六、噬菌體生物擴增法（PhaB）

PhaB法是利用分枝桿菌噬菌體D29感染活的分枝桿菌，用硫酸亞鐵胺殺滅Mtb外的噬菌體，D29在菌體內(nèi)大量擴增導(dǎo)致細菌溶解產(chǎn)生蝕斑，通過計數(shù)蝕斑數(shù)目來衡量Mtb在無藥和含藥培養(yǎng)基中活菌數(shù)量，從而判斷其耐藥性。裂解型分枝桿菌噬菌體D29由Froman等1954年首次分離成功，可感染快生長的恥垢分枝桿菌和慢生長的Mtb［35］。D29在恥垢分枝桿菌中發(fā)生溶菌循環(huán)的一個周期為90min，快于對Mtb的溶菌時間（13h）。該方法的基本操作是將待檢培養(yǎng)物或涂片抗酸桿菌陽性痰標(biāo)本與抗結(jié)核藥物作用24～48h后，加入分枝桿菌噬菌體D29，37℃孵育1h，加入殺病毒劑，室溫作用5min，再加入指示細胞（通常采用恥垢分枝桿菌），混合在固體瓊脂平板上，37℃孵育24～72h，并設(shè)未加藥對照管。計數(shù)每塊平板上的嗜菌斑數(shù)目，計算每個菌株的加藥管與對照管的嗜菌斑減少百分比。加藥管與對照管的嗜菌斑減少百分比超過95%或99%判為敏感，反之為耐藥。該方法與羅氏培養(yǎng)法比較，利福平耐藥性檢測有較高的敏感度和特異度，分別為100%、98%；異煙肼敏感度、特異度稍低，分別為80．4%、80．8%［36］，以 BACTECTMMGITTM960測定結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，阿米卡星耐藥性檢測中PhaB法的敏感度、特異度及符合率分別為89．3%、98．8%、96．3%［37］，有學(xué)者利用此法用于氟喹諾酮類藥物的藥敏實驗時，由于不能識別敏感株，建議在選擇該法行耐藥性檢測時需謹慎［38］。該方法48h內(nèi)可回報結(jié)果，快速、安全、簡單、直觀，無須特殊的設(shè)備，成本低廉，但對操作技術(shù)要求嚴格，易于向發(fā)展中國家推廣。

七、流式細胞儀技術(shù)（FCM）

FCM法是通過向Mtb含藥培養(yǎng)基中加入乙酰乙酸熒光素（FDA）指示劑，活的分枝桿菌能迅速水解外來的FDA為游離的熒光素發(fā)出熒光，通過流式細胞儀檢測帶熒光的分枝桿菌，檢測Mtb的活菌量，從而判斷耐藥性。FDA是一種非極性非熒光物質(zhì)，能夠滲入分枝桿菌胞體內(nèi)，活的分枝桿菌能迅速水解外來的FDA為游離的熒光素而發(fā)出熒光，而被抑制或死亡的菌體由于胞體內(nèi)酯酶大量減少，熒光素生成亦少，再利用流式細胞儀檢測熒光素的含量，從而計算活菌的數(shù)量，測定菌株的耐藥情況?？紤]到安全因素，Moore等［39］對本方法進行了改良，在用FCM檢測前用特殊的化學(xué)物質(zhì)對Mtb進行滅活，在保持檢測高敏感度的前提下，改善了檢測的安全性，且在72h內(nèi)可得出結(jié)果。FCM法檢測分枝桿菌的準(zhǔn)確度和敏感度均較好，但耐藥和敏感的判斷并沒有明確公認的標(biāo)準(zhǔn)，且影響因素較多，如細胞聚集、菌體大小、雜菌等，特異度較差，同時流式細胞儀價格昂貴，技術(shù)要求較高，難以推廣。

上述各種Mtb表型藥敏檢測方法在Mtb耐藥性檢測中發(fā)揮著重要作用，盡管近年來涌現(xiàn)了很多新的Mtb基因型快速藥敏檢測方法，但在將來幾十年中表型藥敏檢測方法作為重要的實驗診斷手段仍將沿用。Mtb表型藥敏檢測不斷發(fā)展，新出現(xiàn)的各種方法也在不斷完善，但仍存在不足，還需要現(xiàn)有的方法進行大量的對比研究，以建立經(jīng)濟、簡便、快速、靈敏的耐藥性檢測方法，并加以推廣應(yīng)用，滿足結(jié)核病臨床發(fā)展的需要，指導(dǎo)臨床合理制定用藥方案，控制耐藥結(jié)核病的擴散。

［1］WHO／IUATLD global working group on anti－tuberculosis drug resistance surveillance．Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis．Geneva：WHO，1997．

［2］劉宇紅，姜廣路，趙立平，等．第四次全國結(jié)核病流調(diào)分枝桿菌藥敏試驗的方法學(xué)探討．中國防癆雜志，2003，25（1）：16－20．

［3］趙玉玲．2種方法檢測結(jié)核分枝桿菌對10種藥物耐藥性的比較．臨床檢驗雜志，2004，22（5）：358－359．

［4］武潔，桂曉紅，李靜，等．比例法與絕對濃度法檢測結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗的比較．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（2）：137－138．

［5］Caviedes L，Lee TS，Gilman RH，et a1．Rapid，efficient detec－tion and drug susceptibility testing ofMycobacterium tuberculosisin sputum by microscopic observation of broth cultures．The Tuberculosis Working Group in Peru．Clin Micmbiol，2000，38（3）：1203－1208．

［6］Makamure B，Mhaka J，Makumbirofa S，et al．Microscopicobservation drug－susceptibility assay for the diagnosis of drugresistant tuberculosis in Harare，Zimbabwe．PLoS One，2013，8（2）：e55872．

［7］Rasslan O，Hafez SF，Hashem M，et al．Microscopic observation drug susceptibility assay in the diagnosis of multidrug－resistant tuberculosis．Int J Tuberc Lung Dis，2012，16（7）：941－946．

［8］陸俊梅，王潔，黃曉辰，等．顯微鏡觀察藥物敏感性檢測技術(shù)在痰標(biāo)本直接藥敏試驗中的應(yīng)用．中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，45（1）：21－25．

［9］Verma JS，Rawat D，Hasan A，et al．The use of E－test for the drug susceptibility testing ofMycobacterium tuberculosis－A solution or an illusion？Indian J Med Microbiol，2010，28（1）：30－33．

［10］Pfyffer GE，Bonato DA，Ebrahimzadeh A，et al．Multicenter laboratory validation of susceptibility testing ofMycobacterium tuberculosisagainst classical second－line and newer antimicrobial drugs by using the radiometric BACTEC 460technique and the proportion method with solid media．J Clin Microbiol，1999，37（10）：3179－3186．

［11］張娟，蔣俊，張紅，等，MGIT960與羅氏培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗中的比對分析．中國防癆雜志，2011，33（6）：361－365．

［12］Siddiqi S，Ahmed A，Asif S，et al．Direct drug susceptibility testing ofMycobacterium tuberculosisfor rapid detection of multidrug resistance using the Bactec MGIT 960system：a multicenter study．J Clin Microbiol，2012，50（2）：435－440．

［13］Otu J，Antonio M，Cheung YB，et al．Comparative evaluation of BACTEC MGIT 960with BACTEC 9000MB and LJ for isolation of mycobacteria in The Gambia．J Infect Dev Ctries，2008，2（3）：200－205．

［14］Wilson ML，Stone BL，Hildred MV，et al．Comparison of recovery rates for mycobacteria from BACTEC 12Bvials，Middlebrook 7H11－selective 7H11biplates，and Lowenstein Jensen slants in a public health mycobacteriology laboratory．J Clin Microbiol，1995，33（9）：2516－2518．

［15］Nair D，Capoor MR，Rawat D，et al．Standardization of first and second－line antitubercular susceptibility testing using BacT Alert 3Dsystem：a report from a tertiary care centre in India．Braz J Infect Dis，2009，13（6）：422－426．

［16］Baylan O，Kisa O，Albay A，et a1．Evaluation of a new automated，rapid，colorimetric culture system using solid medium for laboratory diagnosis of tuberculosis and determination of antituberculosis drug susceptibility．Int Tuberc Lung Dis，2004，8（6）：772－777．

［17］Akihisa T，F(xiàn)ranzblau SG，Ukiya M，et al．Antitubercular activity of triterpenoids from Asteraceae flowers．Biol Pharm Bull，2005，28（1）：158－160．

［18］Sriram D，Yogeeswari P，Madhu K．Synthesis andin vitroandin vivoantimycobacterial activity of isonicotinoyl hydrazones．Bioorg Med Chem Lett，2005，15（20）：4502－4505．

［19］Yajko DM，Madej JJ，Lancaster MV，et al．Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents forMycobacterium tuberculosis．J Clin Microbiol，1995，33 （9）：2324－2327．

［20］Farnia P，Mohammadi F，Mirsaedi M，et al．Bacteriological follow－up of pulmonary tuberculosis treatment：a study with a simple colorimetric assay． Microbes Infect，2004，6（11）：972－976．

［21］李桂蓮，張敬蕊，趙秀芹，等．微孔板Alamar Blue顯色法檢測結(jié)核分枝桿菌臨床分離株利福平和異煙肼耐藥性研究．中國人獸共患病學(xué)報，2012，28（4）：319－322．

［22］Palomino JC，Martin A，Camacho M，et al．Resazurin microtiter assay plate：simple and inexpensive method for detection of drug resistance inMycobacterium tuberculosis． Antimicrob Agents Chemother，2002，46（8）：2720－2722．

［23］Martin A，Camacho M，Portaels F，et a1．Resazurin microtiter assay plate testing ofMycobacterium tuberculosissusceptibilities to second－line drugs：rapid，simple，and inexpensive method．Antimicrob Agents Chemother，2003，47（11）：3616－3619．

［24］張宗德，邢愛英，劉忠泉，等．噻唑藍和刃天青法在一線抗結(jié)核藥物藥敏試驗中的應(yīng)用．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2008，31（9）：989－992．

［25］Mshana RN，Tadesse G，Abate G，et al．Use of 3－（4，5－dimethylthiazol－2－yl）－2，5－diphenyl tetrazolium bromide for rapid detection of rifampin－resistantMycobacterium tuberculosis．J Clin Microbiol，1998，36（5）：1214－1219．

［26］Pontino MV，Di Giulio B，F(xiàn)ernández C，et al．Evaluation of a colorimetric micromethod for determining the minimal inhibitory concentration of antibiotics againstMycobacterium tuberculosis．Rev Argent Microbiol，2006，38（3）：145－151．

［27］Ferrari Mde L，Telles MA，F(xiàn)errazoli L，et al．Susceptibility ofMycobacterium tuberculosisto first－line antimycobacterial agents in a Brazilian hospital：assessing the utility of the tetrazolium（MTT）microplate assay．Mem Inst Oswaldo Cruz，2010，105（5）：661－664．

［28］Morcillo N，Di Giulio B，Testani B，et al．A microplate indicator－based method for determining the susceptibility of multidrug－resistantMycobacterium tuberculosisto antimicrobial agents．Int J Tuberc Lung Dis，2004，8（2）：253－259．

［29］Coban AY，Uzun M，Akgunes A，et al．Comparative evaluation of the microplate nitrate reductase assay and the rezasurin microtitre assay for the rapid detection of multidrug resistantMycobacterium tuberculosisclinical isolates．Mem Inst Oswaldo Cruz，2012，107（5）：578－581．

［30］Syre H，Valvatne H，Sandven P，et al．Evaluation of the nitratebased colorimetric method for testing the susceptibility ofMycobacterium tuberculosisto streptomycin and ethambutol in liquid cultures．J Antimicrob Chemother，2006，57（5）：987－991．

［31］戚超群，楊貴發(fā)．結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)快速煙酸測定法的研究．社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志，2008，6（9）：19－20．

［32］Singh P，Wesley C，Jadaun GP，et al．Comparative evaluation of L?wenstein－Jensen proportion method，BacT／ALERT 3D system，and enzymatic pyrazinamidase assay for pyrazinamide susceptibility testing ofMycobacterium tuberculosis．J Clin Microbiol，2007，45（1）：76－80．

［33］Subramanyam B，Sivaramakrishnan G，Dusthackeer A，et al．Phage lysin to control the overgrowth of normal flora in processed sputum samples for the rapid and sensitive detection ofMycobacterium tuberculosisby luciferase reporter phage assay．BMC Infect Dis，2013，13：44．

［34］Yamazaki T，Sato N，Yamashita K，et al．Antimicrobial susceptibility testing forMycobacterium tuberculosisby the bioluminescence assay of mycobacterial ATP using filamentous cell treatment．Rinsho Byori，2000，48（2）：167－173．

［35］Froman S，Will Dw，Bogen E．Bacteriophage active against virulentMycobacterium tuberculosis．I．Isolation and activity．Am J Public Health Nations Health，1954，44（10）：1326－1333．

［36］Chauca JA，Palomino JC，Guerra H．Evaluation of rifampicin and isoniazid susceptibility testing ofMycobacterium tuberculosisby a mycobacteriophage D29－based assay．J Med Microbiol，2007，56（Pt3）：360－364．

［37］李同心，崔振玲，汪小黎，等．噬菌體生物擴增法檢測結(jié)核分枝桿菌阿米卡星耐藥性方法的建立及應(yīng)用評價．中國防癆雜志，2011，33（3）：158－162．

［38］Stella EJ，de la Iglesia AI，Morbidoni HR，et al．Comparison of the performance of two mycobacteriophage D29－based protocols for fluoroquinolone susceptibility testing inMycobacterium tuberculosis．J Microbiol Methods，2009，79（3）：371－373．

［39］Moore AV，Kirk SM，Callister SM，et al．Safe determination of susceptibility ofMycobacterium tuberculosisto antimycobacterial agents by flow cytometry．J Clin Microbiol，1999，37（3）：379－483．