張巍 孟令超 袁云

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?。╩otor neuron disease，MND）又稱肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），是以上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受累為主要病理改變的進(jìn)行性、致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性?。?］，主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌無力和肌萎縮，部分患者伴隨癡呆。此病缺乏有效的治療措施，患者病程后期往往因出現(xiàn)吞咽困難和呼吸肌無力而死亡。MND發(fā)病率約為（1.5～2.5）／10萬，多數(shù)患者為散發(fā)型（sporadic MND，sMND），5%～10%為家族型 （familial MND，fMND）。其特征性的病理改變是進(jìn)行性上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元脫失伴隨反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生，殘存下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)Bunina小體，在大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)下行的錐體束出現(xiàn)變性改變。1991年Leigh等在MND患者的腦和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)泛素化團(tuán)樣或圓狀包涵體，成為MND的特征性病理改變，這些改變也出現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)非運(yùn)動(dòng)區(qū)，包括額顳葉皮質(zhì)、新紋狀體、黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞以及營養(yǎng)不良的軸索等，被認(rèn)為與MND患者癡呆、錐體外系病變等一系列臨床表現(xiàn)相關(guān)，從而改變了MND為單一運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)受累的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。2006年研究者們明確了TAR DNA結(jié)合蛋白43（transactivation response DNA－binding protein 43，TDP－43）是MND患者腦和脊髓中泛素陽性、Tau蛋白和突觸核蛋白陰性包涵體的主要成分［2－3］，而以MND為代表的病理性TDP－43蛋白沉積為主的一系列疾病被統(tǒng)稱為TDP－43蛋白?。═DP－43 proteinopathies）［4］，后者與 Tau蛋白病（Tauopa－thies）、突觸核蛋白?。╝－synucleinopathies）并列成為以蛋白沉積為基礎(chǔ)的神經(jīng)變性病的新分類?；诮陙鞹DP－43蛋白在MND研究中逐漸顯露的重要性，該文就TDP－43蛋白在MND中的病理表現(xiàn)形式、沉積部位、影響因素及其在MND發(fā)病中的機(jī)制和意義做一綜述。

1 TDP－43蛋白

TDP－43蛋白由定位于Chr1p36.2的TARDBP基因編碼，是具有414個(gè)氨基酸，相對分子量為43000的蛋白質(zhì)，它包含2個(gè)RNA識別區(qū)和一個(gè)富含甘氨酸的末端，使其可以結(jié)合單鏈DNA、RNA和蛋白質(zhì)。除具有轉(zhuǎn)錄和剪切調(diào)控的功能外，TDP－43蛋白也參與了microRNA處理、細(xì)胞分裂和信使RNA的穩(wěn)定等。TARDBP基因敲除的小鼠于胚胎早期即死亡，表明TDP－43蛋白對胚胎早期發(fā)育具有重要作用［4－5］。生理性 TDP－43蛋白主要分布在細(xì)胞核，少量出現(xiàn)在核周胞質(zhì)。由于TDP－43蛋白具有廣泛的生理功能，其表達(dá)受到核定位信號和轉(zhuǎn)移信號等的調(diào)控并易于受到機(jī)體生理狀態(tài)的影響，在疾病和應(yīng)激狀態(tài)下，TDP－43蛋白可表現(xiàn)為核內(nèi)包涵體、胞質(zhì)聚集體、核周深染、胞質(zhì)彌漫著色等一系列病理形態(tài)學(xué)改變，病理性TDP－43蛋白可由TARDBP基因突變以及磷酸化、泛素化和N末端截短等修飾過程所導(dǎo)致，與生理性結(jié)構(gòu)比較，其狀態(tài)不穩(wěn)定而更易聚集［2，6］。

2 TDP－43蛋白在MND中的表達(dá)

在散發(fā)型和非超氧化物歧化酶1（superoxide dimutase 1，SOD1）突變的fMND中，TDP－43均為主要和特征性的病理沉積蛋白［1－2］，類似的蛋白沉積模式也出現(xiàn)在單純額顳葉變性（frontotemporal lobar degeneration，F(xiàn)TLD）和伴隨額顳葉變性的MND（FTLD－MND）中，提示 TDP－43蛋白沉積可致不同 臨床 表 型［2－3，7－8］。Mackenzie等 研 究 111 例MND患者發(fā)現(xiàn)，在所有sMND、伴隨癡呆的MND和無SOD1突變的fMND患者的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了TDP－43陽性包涵體，伴核內(nèi)TDP－43蛋白減少［7］。脊髓 TDP－43陽性包涵體主要出現(xiàn)在前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞，在腦干出現(xiàn)在紅核、面神經(jīng)核、舌下神經(jīng)核、疑核、下橄欖核及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)，而在大腦主要出現(xiàn)在丘腦和運(yùn)動(dòng)皮層神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，其他區(qū)域包括脊髓背根神經(jīng)節(jié)、脊髓后角、小腦齒狀核、外展神經(jīng)核和動(dòng)眼神經(jīng)核相對少見。包涵體也可出現(xiàn)在膠質(zhì)細(xì)胞，主要在少突膠質(zhì)細(xì)胞，偶見于星形細(xì)胞突起中，另有少量出現(xiàn)在細(xì)胞核內(nèi)和營養(yǎng)不良的軸索。神經(jīng)元內(nèi)TDP－43陽性包涵體形態(tài)各異，在胞質(zhì)中呈線絲樣、圓狀、致密小體樣或顆粒樣外觀。超微結(jié)構(gòu)下這些包涵體為顆粒細(xì)絲結(jié)構(gòu)，但并不具有類淀粉細(xì)絲的特點(diǎn)，其剛果紅染色為陰性［1］。此外，TDP－43蛋白也在MND患者的腦脊液、血液甚至皮膚組織中出現(xiàn)異常表達(dá)［9－10］。而在患者肌肉組織中的表達(dá)水平和對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TDP－43蛋白也出現(xiàn)在其他神經(jīng)系統(tǒng)變性病中，與在MND中的廣泛沉積相比，TDP－43蛋白在其他神經(jīng)變性病和正常衰老大腦中僅在邊緣系統(tǒng)呈局灶沉積，提示TDP－43蛋白的病理改變雖已不再具有疾病特異性，其分布模式還是與特定疾病相關(guān)。

TDP－43蛋白沉積和MND其他病理改變之間的關(guān)系目前尚無定論。盡管在出現(xiàn)TDP－43陽性包涵體的部位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元脫失更為顯著，但神經(jīng)元脫失出現(xiàn)在所有sMND中，而在所有神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的包涵體中TDP－43蛋白的陽性率尚不足50%［1，11］。TDP－43陽性包涵體和 Bunina小體關(guān)系密切，在對18例尸檢的MND病例中均發(fā)現(xiàn)存在TDP－43包涵體，其中15例存在Bunina小體，出現(xiàn)Bunina小體和TDP－43包涵體的前角細(xì)胞占據(jù)前角細(xì)胞總數(shù)的比例分別為17.1%和46.4%。在出現(xiàn)Bunina小體的神經(jīng)元中，其TDP－43陽性包涵體的出現(xiàn)率高于不出現(xiàn)Bunina小體的神經(jīng)元，超微結(jié)構(gòu)觀察顯示TDP－43陽性的細(xì)絲樣結(jié)構(gòu)和Bunina小體早期結(jié)構(gòu)相互交聯(lián)［11］。盡管TDP－43蛋白是泛素陽性包涵體的主要成分，但二者的表達(dá)也并非完全平行。在sMND患者下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元線團(tuán)樣和圓狀包涵體、海馬齒狀回顆粒細(xì)胞、新紋狀體小神經(jīng)元的圓狀和半月形包涵體內(nèi)，TDP－43蛋白和泛素共同表達(dá)，而在蒼白球、丘腦、皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞TDP－43陽性包涵體中，僅有微弱或者無泛素表達(dá)［1］。在海馬齒狀回顆粒細(xì)胞泛素陽性包涵體中，TDP－43陽性包涵體的數(shù)量和頻率最多。此外在FTLD－MND患者中，TDP－43陽性包涵體出現(xiàn)在Tau蛋白沉積之后，且與磷酸化Tau蛋白在病理分布方面并不具有平行性［12］。

3 TDP－43蛋白和MND相關(guān)基因

不同基因突變導(dǎo)致的MND中可以存在或缺乏病理性 TDP－43蛋白。攜帶SOD1突變的fMND中無TDP－43蛋白表達(dá)，而TDP－43蛋白編碼基因TARDBP的突變出現(xiàn)在4%的fMND和約1%～5%的sMND 中［13］，其主要 病 理 改變 為TDP－43蛋白病。位于16號染色體上的肉瘤融合基因（fused in liposarcoma，F(xiàn)US）編碼的 FUS蛋白出現(xiàn)在一小部分MND和泛素陽性的FTLD患者中，其神經(jīng)元內(nèi)包涵體的TDP－43蛋白、Tau蛋白和共核蛋白表達(dá)均為陰性［14］。2011年發(fā)現(xiàn)的位于Chr9p21的C9ORF72基因?yàn)橐桓叨缺Ｊ匦蛄?，該基因非編碼區(qū)突變導(dǎo)致的六核苷酸重復(fù)擴(kuò)增序列GGGGCC是 MND、FTLD－MND及 FTLD的重要遺傳改變，攜帶該突變的患者主要病理改變?yōu)門DP－43蛋白?。?5］。

此外，研究者們在另一TDP－43蛋白病FTLD中依據(jù)表型描述了4種TDP－43蛋白病理類型，其中A型與編碼分泌型生長因子Progranulin的基因GRN突變有關(guān)，后者是家族型FTLD最常見突變。B型與FTLD－MND有關(guān)，C型與語義性癡呆有關(guān)，D型和編碼含纈酪肽蛋白（valosin containing protein）的VCP基因突變有關(guān)［16］。值得指出的是盡管GRN突變在MND中少見，仍有研究發(fā)現(xiàn)GRN的常見變異是TDP－43蛋白異常表達(dá)的遺傳易感因素。而VCP基因突變的表型除了FTLD外還包括包涵體肌炎和Paget骨病，在后兩者中亦發(fā)現(xiàn)了TDP－43蛋白在肌肉的表達(dá)。因此，盡管目前尚不能明確TDP－43蛋白與大多數(shù)MND基因及其編碼蛋白之間的相關(guān)性，但這些改變的出現(xiàn)提示不同基因異常導(dǎo)致MND發(fā)病的過程可能均有TDP－43蛋白參與。

4 TDP－43蛋白在MND中的致病機(jī)制

與SOD1在MND中的致病學(xué)說類似，TDP－43蛋白的致病學(xué)說也主要存在2類觀點(diǎn)。一些學(xué)者認(rèn)為該蛋白的毒性作用源于其正常功能的喪失，TDP－43蛋白在細(xì)胞核中主要參與基因的轉(zhuǎn)錄及RNA的剪切，可以連接并穩(wěn)定神經(jīng)絲輕鏈基因的mRNA，TARDBP基因敲除后，TDP－43蛋白能夠自由與其他mRNA底物相互作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。體外實(shí)驗(yàn)顯示敲除TARDBP基因的細(xì)胞系也出現(xiàn)了細(xì)胞核形態(tài)異常、樹突生長異常及細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)異常并導(dǎo)致細(xì)胞死亡［4－5，17］。上述發(fā)現(xiàn)表明生理性TDP－43蛋白對于維持正常突觸功能及應(yīng)對細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)至關(guān)重要。另一些學(xué)者認(rèn)為TDP－43蛋白的毒性作用源于其異常功能的獲得。在過表達(dá)人全長TDP－43蛋白及各種TDP－43剪切體的酵母中，只有包含不完整RRM結(jié)構(gòu)域或形成聚集體的TDP－43蛋白具有毒性作用，表明TDP－43蛋白的異常聚集使其獲得了毒性功能［17］。研究者將突變的人TARDBP基因轉(zhuǎn)染到大鼠黑質(zhì)，TDP－43蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，神經(jīng)元胞質(zhì)中出現(xiàn)了彌漫性或顆粒樣的表達(dá)，伴隨膠質(zhì)增生、神經(jīng)元變性以及進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)功能障礙等類似MND的表現(xiàn)，但在神經(jīng)元中并未發(fā)現(xiàn)成熟的包涵體結(jié)構(gòu)，提示在不形成聚集體的情形下，TDP－43蛋白仍具有神經(jīng)元毒性。支持這一觀點(diǎn)的更有力證據(jù)為，在TDP－43蛋白的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中成功復(fù)制了在SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即過度表達(dá)野生型TDP－43蛋白和攜帶TARDBP基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠一樣具有神經(jīng)毒性，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)細(xì)胞變性［18］。

總之，TDP－43蛋白已經(jīng)被確立為MND的特征性病理沉積蛋白，越來越多的證據(jù)表明，TDP－43蛋白在MND中的出現(xiàn)具有致病意義，和SOD1相比TDP－43蛋白更具有代表性，更廣泛表達(dá)于不同遺傳背景和不同表型下的MND中。TDP－43蛋白的發(fā)現(xiàn)拓寬了人們對MND的認(rèn)識，圍繞TDP－43蛋白進(jìn)行的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)有可能進(jìn)一步闡釋MND的發(fā)病機(jī)制，并將加快對MND乃至一系列神經(jīng)變性病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)程。

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