李海峰 郝洪軍 謝琰臣

視神經(jīng)脊髓炎（NMO）是一種致殘性自身免疫疾病。血清水通道蛋白4（AQP4）抗體有助于對NMO與多發(fā)性硬化（MS）進(jìn)行鑒別，這對臨床診治這兩種疾病具有重要意義，因?yàn)閮烧叩念A(yù)后以及療法不同。血清中的AQP4抗體與NMO發(fā)病直接有關(guān)［1］，且其血清水平與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)［2］。臨床實(shí)踐中，只有一些檢測中心進(jìn)行該抗體的檢查，其他相關(guān)單位需要在常溫或冰凍的情況下運(yùn)輸標(biāo)本到檢測中心；臨床研究中，標(biāo)本可能多次被檢測，可能經(jīng)過凍融過程。Jarius等［3］于2011年9月在Clin Chem Lab Med雜志發(fā)表論文首次報(bào)道儲(chǔ)存條件和凍融過程對血清AQP4抗體水平的影響。

該作者采用常規(guī)方法從1例NMO患者抽血送檢，常溫（18℃）下以1800r／min離心8min。將患者的血清標(biāo)本分成多個(gè)小份，同時(shí)分別儲(chǔ)存在不同條件下（表1）。然后采用英國RSR公司生產(chǎn)的商品化ELISA試劑盒進(jìn)行雙孔檢測，其抗原為重組的全長人類AQP4。結(jié)果顯示AQP4抗體水平在試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)（5～160AU／mL）。無論儲(chǔ)存溫度為－80℃、4℃還是常溫，以及凍融次數(shù)多少（無凍融、1、2、3或5次凍融），結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，平均變異系數(shù)（CV）為2.66%，提示不同條件下儲(chǔ)存標(biāo)本的ELISA檢測結(jié)果之間具有高度可重復(fù)性。該研究提示至少在8d內(nèi)于室溫或4℃儲(chǔ)存或反復(fù)凍融對檢測結(jié)果無影響。但作者提出，該份血清中AQP4抗體水平較高，并不處于正常參考值低限，也不是溶血標(biāo)本的血清，還需要進(jìn)一步使用抗體水平較低或溶血標(biāo)本研究不同儲(chǔ)存條件是否會(huì)影響所檢測到的AQP4水平。該作者同時(shí)指出，總體來講，抗體相對穩(wěn)定而一些蛋白成分抗原的穩(wěn)定性較差，如果需要同時(shí)檢查其他蛋白成分，如細(xì)胞因子，則應(yīng)該儲(chǔ)存在－80℃或干冰運(yùn)輸，并避免凍融過程。

Jarius長期從事NMO患者的自身抗體研究，截止2011年9月底在MEDLINE檢索可以查到其以第一作者或參與研究的抗體檢測文章31篇，涉及AQP4抗體檢測方法學(xué)建立、AQP4抗體在NMO病譜疾病中的意義、血清和腦脊液中AQP4抗體檢測的意義以及多種副腫瘤綜合征相關(guān)抗體等，且其抗體檢測多數(shù)采用ELISA方法?；诖耍梢源_認(rèn)其具有豐富的ELISA檢測經(jīng)驗(yàn)，所得結(jié)果可靠，其平行孔的CV最大者僅為6.61%，也說明其檢測時(shí)加樣的準(zhǔn)確性很好?；跍?zhǔn)確的檢測，以及整體CV很小，可以確認(rèn)儲(chǔ)存條件和反復(fù)凍融對AQP4抗體檢測結(jié)果無影響。

對該研究應(yīng)予注意:（1）ELISA方法檢測蛋白或抗體可能因被測物的不同而使標(biāo)本處理過程對檢測結(jié)果的可靠性產(chǎn)生不同影響，最終影響研究的科學(xué)性；（2）標(biāo)本中如果抗體水平過高，可能會(huì)超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限，對于接近上限的檢測值，需要考慮稀釋標(biāo)本后重新檢測，以確保測出其真實(shí)水平，這是ELISA的基本原理決定的；（3）兩個(gè)平行孔檢測的結(jié)果按照統(tǒng)計(jì)學(xué)理論亦可進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差和CV運(yùn)算，但其結(jié)果的可靠性相較于通過多個(gè)（如6～8個(gè)）平行孔結(jié)果計(jì)算所得結(jié)果要差；不過，這個(gè)研究總體和各處理組的平行孔結(jié)果的變異系數(shù)均很小且接近，仍提示其結(jié)果具有高度可重復(fù)性。

表1 NMO患者血清樣本經(jīng)不同方法處理后其ELISA檢測結(jié)果

其他以ELISA方法檢測的被測物水平受標(biāo)本處理、儲(chǔ)存條件和凍融影響的研究（各研究采用符合各種被測物檢測原理的商品化ELISA試劑盒）包括:腦脊液中的磷酸化神經(jīng)絲重鏈水平不受反復(fù)凍融影響［4］；血清中的麻疹、風(fēng)疹和水痘病毒抗體水平也不受反復(fù)凍融影響［5］；血漿和血清白細(xì)胞介素－6水平不受抗凝劑、抽血后延遲處理標(biāo)本或反復(fù)凍融的影響［6］；腦脊液中基質(zhì)金屬蛋白酶－2水平受室溫和4℃儲(chǔ)存的影響而下降，但不受反復(fù)凍融的影響［7］；延遲處理標(biāo)本、室溫儲(chǔ)存可以使血管內(nèi)皮生長因子水平顯著增高，但不受－80℃儲(chǔ)存2年以及反復(fù)凍融的影響［8］；反復(fù)凍融使血漿中的von Willebrand因子水平顯著下降［9］。可見不同被測物在不同的標(biāo)本處理、儲(chǔ)存和凍融條件下檢測到的水平并不都能反映留取標(biāo)本時(shí)被測物的水平。如果考慮到被測物的生物活性，還需要對其活性是否受到上述因素影響進(jìn)行評價(jià)。這樣得到的檢測值才能更好反映其在體內(nèi)的水平和活性。

抗AQP4抗體以及前述被測物均為診斷、病情嚴(yán)重程度和療效監(jiān)測的生物學(xué)標(biāo)志物。準(zhǔn)確檢測這些被測物的水平和活性，能夠幫助臨床決策，也能夠更好完成臨床科研。尤其是在被測物被轉(zhuǎn)運(yùn)到檢測中心或保存多年后進(jìn)行臨床研究時(shí)，研究者不能忽略其標(biāo)本處理方法和儲(chǔ)存方法而簡單認(rèn)為檢測值就是該被測物的實(shí)際值。確信檢測值前要明確檢測方法的穩(wěn)定性和可靠性，同時(shí)也要充分考慮到未來研究會(huì)將檢測的被測物，查閱相關(guān)方法學(xué)文獻(xiàn)，選擇適合多種被測物檢測的標(biāo)本處理和儲(chǔ)存方法。前述方法學(xué)文獻(xiàn)多發(fā)表在臨床檢驗(yàn)雜志上，而這也正是臨床醫(yī)生進(jìn)行研究時(shí)容易忽略的，應(yīng)予注意。

［1］Jarius S，Wildemann B.AQP4antibodies in neuromyelitis optica:diagnostic and pathogenetic relevance［J］.Nat Rev Neurol 2010，6:383－392.

［2］Jarius S，Aboul－Enein F，Waters P，et al.Antibody to aquaporin－4in the long－term course of neuromyelitis optica［J］.Brain，2008，131:3072－3080.

［3 ］Jarius S，Wildemann B.Effect of storage conditions and freeze／thaw cycles on aquaporin－4antibody（NMO－IgG）serum levels［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49:2121－2122.

［4］Petzold A，Keir G，Green AJ，et al.A specific ELISA for measuring neurofilament heavy chain phosphoforms［J］.J Immunol Methods，2003，278:179－190.

［5］Pinsky NA，Huddleston JM，Jacobson RM，et al.Effect of multiple freeze－thaw cycles on detection of measles，mumps，and rubella virus antibodies［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2003，10:19－21.

［6］Knudsen LS，Christensen IJ，Lottenburger T，et al.Pre－analytical and biological variability in circulating interleukin 6in healthy subjects and patients with rheumatoid arthritis［J］.Biomarkers，2008，13:59－78.

［7］Sulik A，Wojtkowska M，Oldak E.Preanalytical factors affecting the stability of matrix metalloproteinase－2concentrations in cerebrospinal fluid［J］.Clin Chim Acta，2008，392:73－75.

［8 ］Hetland ML，Christensen IJ，Lottenburger T，et al.Circulating VEGF as a biological marker in patients with rheumatoid arthritis？Preanalytical and biological variability in healthy persons and in patients［J］.Dis Markers，2008，24:1－10.

［9］Smith BW，Strakova J，King JL，et al.Validated sandwich ELISA for the quantification of von Willebrand factor in rabbit plasma［J］.Biomark Insights，2010，5:119－127.