張麗花

江蘇省張家港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 張家港 215600

一種幽門螺桿菌臨床菌株的分離培養(yǎng)和保存方法介紹

張麗花

江蘇省張家港市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 張家港 215600

目的：介紹一種幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）臨床菌株的分離培養(yǎng)和保存方法。方法：采用心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基，同時以微需氧盒和微需氧袋對50份臨床標(biāo)本培養(yǎng)HP，并以心腦浸液液體培養(yǎng)基保存菌株。結(jié)果：微需氧盒中共檢出23份HP陽性，而微需氧袋中只檢出3份HP陽性。心腦浸液液體培養(yǎng)基保存菌株復(fù)蘇成功率為95.6%。結(jié)論：心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基微需氧盒法可以成功分離培養(yǎng)HP，心腦浸液液體培養(yǎng)基保存菌株復(fù)蘇成功率高。

幽門螺桿菌；分離培養(yǎng)；菌種保存

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）是一種螺旋狀、革蘭染色陰性、微需氧的細(xì)菌，由Warren和Marshall于1983年成功從胃黏膜組織中分離［1］?，F(xiàn)已證實(shí)HP與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織（MALT）淋巴瘤以及胃癌密切相關(guān)，1994年世界衛(wèi)生組織／國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（WHO／IARC）將其列為胃癌的I類致癌因子［2－4］。目前有多種方法可用于診斷HP感染，細(xì)菌培養(yǎng)被視為診斷HP感染的金標(biāo)準(zhǔn)［5］，也是HP研究工作的基礎(chǔ)。但由于HP的培養(yǎng)條件要求較高，抵抗力較低，導(dǎo)致許多實(shí)驗(yàn)室不易獲取或保存HP菌種，從而影響研究工作的開展。本文介紹一種簡便的HP臨床菌株分離培養(yǎng)和保存的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 本院胃炎、消化道潰瘍患者在胃鏡檢查時取下的胃和十二指腸活組織標(biāo)本50例。病人受檢前2周未服用抗生素、非甾體類抗炎藥、質(zhì)子泵抑制劑、黏膜保護(hù)劑等。

1.1.2 心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基 稱取23.5g心腦浸液瓊脂（OXOID CM0375）在500ml蒸餾水中，煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15分鐘。取出自然冷卻至50℃，加入2ml幽門螺桿菌選擇劑（萬古霉素Vancomycin 5mg、頭孢磺啶Cefsulodin 2.5mg、磺胺增效劑Trimethoprim 2.5mg、兩性霉素B Amphotercin B2.5mg，溶于2ml無菌蒸餾水中），再加入35ml（7%）脫纖維羊血，混勻后澆平板。

1.1.3 心腦浸液液體培養(yǎng)基 稱取0.37g心腦浸液肉湯（OXOID CM0225）于50毫升的小燒杯中，再加入10毫升蒸餾水，用玻璃棒攪拌均勻。把上述溶液轉(zhuǎn)入三角燒瓶中，連同1ml EP管、甘油一同高壓滅菌。在EP管中加入0.8ml液體培養(yǎng)基、0.05ml胎牛血清、0.15ml甘油，用來保存HP。

1.1.4 微需氧產(chǎn)氣盒（袋） 法國生物梅里埃微需氧產(chǎn)氣盒（袋）（GENbox／bag microaer）和微需氧氣體產(chǎn)生囊。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng) 將胃或腸組織塊放入1ml無菌生理鹽水中，充分振搖后取各100μl加入二塊相應(yīng)的心腦浸液瓊脂平板中，涂抹均勻；兩塊平板分別放入微需氧盒和微需氧袋（含5%O2、10%CO2、85%N2），快速地將氣體發(fā)生器放入微需氧盒和微需氧袋，再取一塊紗布，用蒸餾水浸濕，避開氣體發(fā)生器，放入微需氧盒和微需氧袋中，37℃培養(yǎng)3～7天。

1.2.2 菌株鑒定 觀察平板，挑取可疑菌落，革蘭氏染色，觸酶試驗(yàn)，氧化酶試驗(yàn)，脲酶試驗(yàn)。

1.2.3 菌株保存 挑取少量HP細(xì)菌加入含心腦浸液液體培養(yǎng)基的EP管中，充分混勻，用封口膠封閉、標(biāo)記；放入－70℃速凍冰箱中冷凍保存。

1.2.4 菌株復(fù)蘇 取出菌種，在固體培養(yǎng)基平板中加入1滴菌液，用接種環(huán)涂勻，放入微需氧盒，37℃培養(yǎng)3～5天。

2 結(jié)果

經(jīng)過3～7天培養(yǎng)，產(chǎn)氣盒中共檢出23份HP陽性，而產(chǎn)氣袋中只檢出3份HP陽性。HP在心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基上生長緩慢，37℃培養(yǎng)3～5天后才能發(fā)現(xiàn)針尖大小，透明無色，呈露滴狀，不溶血的菌落。觸酶、氧化酶、脲酶試驗(yàn)陽性，革蘭氏染色為陰性的彎曲桿菌，鑒定為HP。

將保存有HP的EP管從中取出，待溶解后接種心腦浸液瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3～5天后，細(xì)菌生長狀況良好。復(fù)蘇成功率為95.6%。

3 討論

HP是一種生存、生長條件都非?？量痰募?xì)菌，對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件要求很高，較一般細(xì)菌難以培養(yǎng)［6－7］。但HP培養(yǎng)還有供純化、保存、分型以及細(xì)菌特性和致病機(jī)制研究等多種科研用途。隨著HP耐藥菌株的日益增加，HP培養(yǎng)還能提供細(xì)菌耐藥性的資料，這對指導(dǎo)臨床用藥極為重要［8－10］。目前，由于各種條件的限制，我國HP培養(yǎng)主要在大學(xué)附屬醫(yī)院和科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行，這使許多醫(yī)院不能進(jìn)行HP的藥敏測試，導(dǎo)致臨床上治療HP感染時，多憑臨床經(jīng)驗(yàn)選擇抗生素，有較大的盲目性。我們運(yùn)用心腦浸液培養(yǎng)基和微需氧產(chǎn)氣盒的方法進(jìn)行HP的培養(yǎng)，方法簡單，分離效果較好。對于現(xiàn)有醫(yī)院普通微生物室來說，不需要另外增加儀器設(shè)備，就可以進(jìn)行HP的常規(guī)分離培養(yǎng)。在心腦浸液培養(yǎng)基中加入萬古霉素、頭孢磺啶、磺胺增效劑、兩性霉素B后，對混有其他雜菌的標(biāo)本更能得到滿意的分離培養(yǎng)效果。

我們運(yùn)用了產(chǎn)氣盒和產(chǎn)氣袋二種培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)效果的比較，顯示運(yùn)用產(chǎn)氣盒能得到較好的分離效果，這可能與產(chǎn)氣袋密封性不如產(chǎn)氣盒有關(guān)，很難維持一個微需氧的環(huán)境有關(guān)。另外，在HP的分離培養(yǎng)中，還應(yīng)注意幾點(diǎn)：①標(biāo)本必須新鮮，運(yùn)送時間不可超過3小時，標(biāo)本必須置入含有2ml以下的無菌生理鹽水或20%葡萄糖中，并保持溫度在4℃；②將標(biāo)本在無菌研磨器研磨后接種，比直接涂抹平板更能得到較佳的分離效果；③心腦浸液培養(yǎng)基必須新鮮配制；④培養(yǎng)在37℃的微需氧環(huán)境中要保持非常潮濕的環(huán)境，可以在盒底放紗布并加足量的水分。

［1］Warren JR，Marshall BJ.Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis［J］.Lancet，1983，1（8336）：1273－1275.

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1007－8517（2013）16－0052－02

2013.06.10）

張麗花（1971－），女，本科，副主任技師。研究方向：臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)。