陳瓊霞鎮(zhèn)鴻燕李 艷劉麗江*

（1 江漢大學病理診斷所 病理技術部，湖北 武漢 430056；2 江漢大學 醫(yī)學院 病理學教研室，湖北 武漢 430056）

基于石蠟包埋組織熒光原位雜交的技術問題

陳瓊霞1鎮(zhèn)鴻燕2李 艷1劉麗江2*

（1 江漢大學病理診斷所 病理技術部，湖北 武漢 430056；2 江漢大學 醫(yī)學院 病理學教研室，湖北 武漢 430056）

石蠟包埋組織；熒光原位雜交技術；問題

熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術是一種分子細胞遺傳學技術，利用核酸探針雜交原理，通過熒光標記的DNA 探針與細胞核內(nèi)的待檢測的DNA靶序列結(jié)合，在熒光顯微鏡下顯示出 DNA 靶序列的雜交信號的一種技術。FISH技術與傳統(tǒng)的放射性核素標記的原位雜交相比，具有快速、檢測信號強、雜交特異性高、可進行多重染色以及無放射性污染等優(yōu)點。目前，F(xiàn)ISH技術已經(jīng)廣泛應用于不同的學科領域，如動植物基因組結(jié)構研究、染色體結(jié)構變異的分析、人類疾病的診斷及發(fā)病機制的研究等。

近年，將FISH技術用于石蠟包埋的人體組織中進行疾病的診斷已經(jīng)有了非常大的進展，成為臨床病理診斷工作中重要的分子生物學技術手段之一，尤其是在乳腺癌的分子靶向的治療標志物HER-2的檢測、淋巴瘤及軟組織腫瘤的分子診斷及靶向的治療中發(fā)揮極為重要的作用[1]。我們在臨床實踐中，探索了石蠟包埋組織中FISH技術的應用，發(fā)現(xiàn)了一些需要注意的技術問題等，現(xiàn)報道如下。

1 組織的固定是基礎

病理科保存的人體組織，首先要經(jīng)過福爾馬林的固定。組織固定的質(zhì)量水平已嚴重影響著各種先進技術尤其是分子生物學技術在臨床病理學中的應用。常規(guī)的組織固定液是指10%的中性福爾馬林，濃度的過高過低，固定液的pH值過高過低均影響組織的固定質(zhì)量。福爾馬林可以使DNA或蛋白質(zhì)的氨基團間形成亞甲基網(wǎng)橋，以利于維持細胞的結(jié)構和組織的形態(tài)，同時也可以保證DNA不發(fā)生降解和斷裂，使后續(xù)的各種檢測技術得以進行。所以，有效的組織固定是非常關鍵的。此外，固定的時間同樣重要，固定時間不足以及固定時間過長也將影響組織固定的質(zhì)量。我們在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，pH值為7.2的10%的福爾馬林固定液將組織固定24h是最為理想的。離體組織的及時固定、大塊組織的切開固定也是保證組織固定質(zhì)量的重要條件。然而，在日常的工作中這些因素又是最容易被忽視的，也是執(zhí)行的不夠好的。因此，我們認為要提高石蠟包埋切片F(xiàn)ISH的質(zhì)量，組織固定是最重要的基礎。

2 石蠟切片的消化是關鍵

石蠟切片的FISH操作過程中，對于切片的前處理以及處理的效果好壞是獲得良好雜交信號的前提。如果處理不夠或處理過度都將直接影響雜交的結(jié)果，導致探針無法與DNA靶序列結(jié)合。因為，在組織固定時，福爾馬林液使DNA及蛋白質(zhì)間形成的亞甲基網(wǎng)橋，阻礙了核酸探針進入細胞內(nèi)，使得雜交信號減弱或不能獲得雜交信號。

酶消化處理是最常用的前處理方法，也是最為關鍵及最難把握的環(huán)節(jié)，操作者需要積累經(jīng)驗，尤其是對不同的組織、不同的待測靶序列的雜交，要采用不同的處理方法。常用于石蠟切片F(xiàn)ISH的消化酶有胃蛋白酶和蛋白酶K，根據(jù)組織切片的厚度和酶的濃度，消化過程一般需要10～30 min的時間[2]。有文獻報告胃蛋白酶對石蠟包埋切片的消化能力比較差，而且所需時間也比較長，雜交后效果不夠理想[3]。蛋白酶K具有很強的活性，配制后不容易很快發(fā)生變性，是理想的FISH前處理消化酶。由于蛋白酶K的消化效率比較高，如果濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高都會導致消化過度，對細胞的結(jié)構有一定的破壞，細胞核變得模糊不清。同時，組織切片也容易發(fā)生脫落，影響雜交結(jié)果。我們的經(jīng)驗是，對于組織結(jié)構多樣又含有比較豐富的結(jié)締組織的樣本，如乳腺浸潤性癌等，采用蛋白酶K的消化要優(yōu)于胃蛋白酶。而對于組織結(jié)構比較單一，細胞密度比較大的組織，如淋巴瘤、軟組織肉瘤等，胃蛋白酶的消化要優(yōu)于蛋白酶K。

酶促反應的條件與三個因素有關，即濃度、溫度和時間。因此，酶消化的時間和溫度也是非常重要的環(huán)節(jié)，不論選擇哪種消化酶，消化處理的時間不易超過30min，特別是使用胃蛋白酶消化時，時間最好控制在20min以內(nèi)。因為，胃蛋白酶容易失活。我們借鑒了其他單位的經(jīng)驗，采用20 g/L的蛋白酶K在50度的溫度下消化20min的方法，取得了比較好的效果。

3 雜交的條件與時間是可變的

樣本的前處理完成之后，依次進行FISH的各個步驟，包括：固定、變性、雜交、沖洗、復染及封片等環(huán)節(jié)。變性的條件是可以根據(jù)組織切片的特點及待測靶序列的不同進行適當?shù)恼{(diào)整。雜交的溫度一般都選擇37℃，但是雜交的時間也是可以根據(jù)上述的不同進行適當?shù)恼{(diào)整。簡言之，不同的實驗室需要選擇一個相對穩(wěn)定的雜交效果好的條件和時間，并確定下來，以保證石蠟切片F(xiàn)ISH的質(zhì)量控制。

綜上所述，基于石蠟切片的FISH技術的建立，使FISH技術很快的從實驗室走向臨床應用中。建立和完善石蠟包埋組織的FISH質(zhì)量控制，將有助于該項技術在臨床的進一步推廣與應用。正確的組織固定、合理的石蠟切片的消化以及可調(diào)整的雜交條件和時間，均將保證高質(zhì)量的FISH檢測結(jié)果的獲得。

[1] NaKayama R,Miura Y,Ogino J,et al.Detection of HEY1-NCOA2 fusion by fluorescence in-situ hybridization in formalin-fixed paraffin-embedded tissues as a possible diagnostic tool for mesenchymal chondrosarcoma[J].Pathol Int.,2012,62(12)∶823-826.

[2] Paternoster SF,Brockman SR,McClure RF,et al.A new method to extract nuclei from paraffin-embedded tissue to study lymphomas using interphase fluorescence in situ hybridization[J].Am J Pathol, 2002,160(6)∶1967-1972.

[3] 王靜,章鈞,張宏,等.FISH檢測石蠟包埋組織切片的理想消化時間[J].廣東醫(yī)學,2010,31(5)∶555-557.

R329.2+3

A

1671-8194（2013）13-0382-01

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