陳卓婧，閻淑男，夏 瀾，龔云飛

(中國計量學院生命科學學院 浙江省生物計量與檢驗檢疫重點實驗室，浙江杭州 310018)

1 青霉素簡介及應用

青霉素屬于β-內酰胺類抗生素，最初從青霉菌培養(yǎng)液中提取而得，分子中含有青霉烷。青霉素的作用機理是干擾細胞壁的合成，使細菌失去細胞壁保護，從而由于菌體胞漿滲透壓高，外界水分不斷滲入致使其膨脹、變形、破裂而死亡。當前，常用的幾種青霉素有氨芐青霉素、青霉素G以及青霉素鹽等，以其高效、價廉而成為獸醫(yī)臨床和人類醫(yī)療使用較普遍的抗生素之一［1］。

2 青霉素的濫用及危害

青霉素高效低毒，且成本低，在臨床上發(fā)揮了重要作用，能夠治療細菌性感染。然而，目前青霉素濫用于預防感染的現(xiàn)象廣泛存在。如當前青霉素在用于預防休克、昏迷、農藥中毒、腦卒中、心力衰竭等繼發(fā)性感染時，其結果已經不能使繼發(fā)感染減少，其原因為患者耐藥菌不易控制，通常為感染細菌［2］。據國內某醫(yī)院統(tǒng)計，對昏迷患者應用抗生素預防治療，43.7%的患者發(fā)生肺炎，而未用抗生素的患者僅20%繼而發(fā)生肺炎［3］。另外，在闌尾切除手術中，加強無菌操作但未用抗生素者，無術后感染現(xiàn)象;而應用抗生素的患者有16.7%發(fā)生傷口感染，7.8%發(fā)生肺部感染、尿路感染等，研究表明，致病菌多為耐藥菌［4］。

濫用青霉素有可能引發(fā)過敏性休克。如患者因患感冒濫用青霉素、皮試陰性、肌注后發(fā)生青敏休克、誤診為暈針等，因耽誤搶救而死亡［4］。

青霉素與鏈霉素聯(lián)用將增大中毒性耳聾發(fā)生率。一遇到細菌感染，就把青、鏈霉素作為各種感染的首選配方來使用，危害極大，很可能產生致聾等不良后果［5］。

鑒于青霉素的潛在危害，為有效規(guī)范青霉素類藥物在醫(yī)療和畜牧業(yè)中的應用，各國或地區(qū)對青霉素的最大殘留限量 (MRL)作了明確規(guī)定。美國FDA規(guī)定，青霉素類抗生素在各類農產品中的MRL不超過5μg·kg-1。歐盟對牛奶中青霉素的MRL規(guī)定:青霉素G 40μg·L-1，苯唑青霉素、鄰氯青霉素、雙氯青霉素均為30μg·L-1。我國農業(yè)部規(guī)定，氨芐青霉素在可食用動物組織中的MRL均為50 μg·kg-1。

3 青霉素殘留檢測方法

目前，青霉素殘留檢測方法可歸納為以下幾類:微生物法、儀器分析法 (包括高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法和氣相色譜法等)、免疫分析法 (如酶聯(lián)免疫分析法和免疫傳感器等)以及基于受體技術的分析法。

3.1 微生物法

目前國內外常用的青霉素殘留檢測的微生物學檢測方法有微生物抑制法和微生物受體法。

3.1.1 嗜熱脂肪芽胞桿菌紙片法

該法的測試菌株采用嗜熱脂肪芽胞桿菌，培養(yǎng)溫度為35～75℃。為摒除潛在的干擾物質，需要對牛奶樣品進行 (82±2)℃的加熱處理。研究顯示，3～4 h可獲得檢測結果，最低檢測限達到4 ng·mL-1［6］。該法的檢測限和準確性滿足我國農業(yè)部對青霉素類殘留的限量要求，且檢測成本低，適合基層單位的常規(guī)檢測。

3.1.2 CHARM II法

需要采用放射性元素先標記目標物的方法［6］。先采用3H或14C標記青霉素，讓其與牛奶中殘留的青霉素競爭細菌表面的特異性受體位點，而樣品的放射強度與樣品的殘留物的含量成反比，所以通過比較其與判定點的放射性強度得出青霉素殘留量。CHARM II法的檢測限為2 ng·mL-1，檢測時間短至15 min。該法以其短時高效、簡便靈敏見長，但成本較高。

3.2 儀器分析法

3.2.1 高效液相色譜法 (HPLC)

HPLC法采用Hypersil ODS柱(200 mm×4.6 mm，5μm)，以0.02 mol·L-1的磷酸二氫鉀緩沖液 (磷酸調pH值至3.5)-甲醇 (65∶35)為流動相，紫外檢測波長為220 nm。其結果顯示，青霉素質量濃度0.498 8～39.9040μg·mL-1，峰面積線性關系良好，平均回收率為99.85%，RSD=0.50%。HPLC法簡便、準確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于青霉素菌絲體中微量青霉素殘留的檢測［7］。

Xie等［8］采用反相液相串聯(lián)熒光檢測器法同時測定雞蛋中的阿莫西林 (AMO)和氨芐青霉素(AMP)。該法先用簡單的液-液萃取方法 (乙腈∶二氯甲烷)對樣品進行萃取，接著用水楊酸與AMO和AMP反應產生熒光衍生物，流動相采用0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀，再采用熒光檢測器法分析該衍生物。AMO和AMP在5.0～800.0 ng·mL-1，檢測結果具良好的線性關系，回收率為77.6%～88.7%，最低檢出限分別為1.2和0.4μg·kg-1，最低定量限分別為3.9和1.5μg·kg-1。經試驗得出，其相應的日內及日間變異 (相對標準偏差)分別小于9.6%和14.8%，變異系數(shù)控制在10%左右。

3.2.2 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法 (HPLC-MS)

HPLC-MS法是將樣品中青霉素經磷酸二氫鈉液提取，加正己烷去除脂肪后，過SPE柱，乙腈洗脫，氮氣吹干，用乙腈-水 (1∶1，V∶V)定容至1 mL，過膜后采用Agilent Eclipse P1us C18柱高效液相色譜分離，電噴霧串聯(lián)質譜法檢測，負離子模式下多反應監(jiān)測，標準曲線法定量。可得結果加標水平為5.0，10.0和20.0μg·kg-1時，回收率在73.58%～101.18%，相對標準偏差為3.00%～8.82%，儀器檢出限為0.1μg·L-1，方法的定量限均為5.0μg·kg-1。該法操作簡單、準確性高，可滿足對動物肺組織中青霉素G和青霉素V殘留的定量分析要求［9］。

3.3 免疫分析法

3.3.1 酶聯(lián)免疫分析法

Samsonova等［10］采用間接ELISA法對牛奶中的氨芐青霉素進行定量分析研究。首先采用活性酯法抗原，再通過動物免疫獲得多克隆抗體。交叉反應結果顯示，與阿洛西林、青霉素G、哌拉西林和羧芐青霉素的交叉反應率分別為17%，10%，5%和10%。繼而建立的間接ELISA法實現(xiàn)了牛奶樣品中氨芐青霉素5 ng·mL-1的最低檢出限。

姜侃等［11］通過制備辣根過氧化物酶標記氨芐青霉素的偶聯(lián)物，采用方陣滴定法選擇抗氨芐青霉素抗體最佳包被濃度。在最佳工作濃度下，通過直接競爭ELISA法繪制標準曲線并計算靈敏度，統(tǒng)計非β-內酰胺類抗生素交叉反應率，最后定量分析乳品中的β-內酰胺類抗生素。結果表明，對于陰性和陽性牛奶樣品的檢測未出現(xiàn)假陽性或假陰性結果。該法檢測結果準確可靠，可廣泛應用于乳品中β-內酰胺類抗生素殘留的檢測。

3.3.2 免疫傳感器

免疫傳感器技術是將高靈敏度的傳感技術與特異性免疫反應結合起來，從而建立用以監(jiān)測抗原-抗體反應的生物傳感器［12］。測定青霉素殘留的方法一般為電化學免疫傳感器。Knecht等［13］將多殘留分析技術與平行親和傳感器聯(lián)用，實現(xiàn)了牛奶中10種抗生素殘留的自動檢測，其中青霉素G的檢測結果滿足規(guī)定的MRL要求。

3.4 其他方法

3.4.1 化學發(fā)光分析法

是將化學發(fā)光反應與流動注射技術聯(lián)用從而建立快速廉價的檢測方法。Chivulescu等［14］采用此技術分析3種β-內酰胺抗生素:阿莫西林、氨芐青霉素和青霉素G。該研究的新穎之處在于對目標樣品進行放射性處理，從而使在線檢測效果放大10～350倍。研究結果顯示，氨芐青霉素和青霉素G的有效檢測范圍為0.05～100.00μg·L-1，阿莫西林的有效檢測范圍為0.25～100.00μg·L-1。該法操作簡單，成本低廉，重現(xiàn)性好，可滿足對此類抗生素的檢測需要。

3.4.2 適配子法

Song等［15］采用適配子技術對青霉素的檢測開展了研究。該方法采用基于熒光雙色法的納米金標記單鏈寡核苷酸。經過篩選，適配子 AMP4，AMP17和AMP18對氨芐青霉素具有較高的靈敏度和特異性。在牛奶樣品的試驗中，檢測結果顯示，基于熒光法和比色法的檢測，其最低檢測限分別為2和10 ng·mL-1，低于規(guī)定的最大殘留標準。因此該法也能用于氨芐青霉素殘留的研究。

3.4.3 基于受體技術的分析法

Cacciatore等［16］研究了一種基于SPR的檢測牛奶中青霉素和頭孢菌素殘留的生物傳感器。該法通過對樣品的特殊前處理，成功消除了因為不同樣品帶來的基質效應影響。研究結果顯示，牛奶中青霉素的最大殘留檢測值為4μg·L-1。

Lamar等［17］從肺炎鏈球菌中提取出的青霉素結合蛋白PBP 2X*，采用一種更新穎的抗原標記技術，建立了用來檢測各類食品中的β-內酰胺類物質殘留的方法。該法可用于定量檢測牛奶、不同動物肉汁、雞蛋和蜂蜜中的頭孢哌酮、頭孢喹肟、頭孢唑啉、鄰氯青霉素、氨芐青霉素和青霉素G，其最低檢出限可達2μg·kg-1。該法具有不需復雜的樣品預處理過程且省時的優(yōu)點。

4 小結

青霉素類抗生素是人類對抗細菌性感染的一大武器，但由于過量攝入青霉素，體內病菌經過自然選擇，抗藥性逐漸增強;同時殘留在動物性食品中(主要為牛奶)的青霉素類藥物會通過富集作用對人體、環(huán)境造成難以估量的危害。所以建立對青霉素殘留的有效精確監(jiān)測具有重要意義。微生物法操作簡單，主要用于定性檢測，不能滿足精確的定量分析，且分析時間長;儀器分析法精確，但對操作人員專業(yè)要求高，且樣品前處理煩瑣;免疫分析技術靈敏度高，可用于陽性樣品的大量篩選，但其抗原抗體制備難度大。因此建立同時具備靈敏度高、操作簡便快捷、分析成本低、前處理簡化、儀器化程度低、通量高等優(yōu)點的檢測技術迫在眉睫。基于受體結合的分析技術在一定程度上彌補了以上不足，因此在青霉素殘留檢測技術值得予以重視。該法的關鍵在于受體的獲得。一般有2種方式:一種是天然提取，即大量培養(yǎng)目標微生物，然后提取。簡單易操作，但存在雜蛋白多，目標蛋白含量少的缺點。另一種是克隆表達。該法雖技術要求高，但一旦建立，目標蛋白就能大量源源不斷獲得，對于建立相關殘留的檢測方法非常方便，值得重視和研究。

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