王真真， 郭新苗， 辛 杰， 張榮超， 郭慶梅， 周鳳琴

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355)

來源于栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim．的傳統(tǒng)中藥包括全瓜蔞 (果實(shí))、瓜蔞子 (種子)和天花粉 (根)，臨床用于治療多種疾?。?］。隨著栝樓綜合開發(fā)應(yīng)用的領(lǐng)域拓寬［2-6］，栝樓新產(chǎn)區(qū)和種植面積不斷增加，對栝樓種質(zhì)優(yōu)良性的要求日趨增高［7］。為了獲得優(yōu)良的中藥種質(zhì)資源，目前各種生物技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于中藥的種質(zhì)資源研究，包括分子標(biāo)記技術(shù)［8-10］、生化標(biāo)記技術(shù)［11-12］、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記技術(shù)［13-15］、種苗快繁技術(shù)［16-17］等。由于栝樓為雌雄異株、異花授粉植物，有的產(chǎn)區(qū)采用葫蘆、絲瓜、南瓜等授粉，使栝樓的種質(zhì)發(fā)生了許多變異，各地瓜蔞生產(chǎn)中存在著種質(zhì)混亂、種苗良莠不齊的現(xiàn)象，栝樓種質(zhì)資源的評價(jià)以及優(yōu)良品種的篩選依然是一個(gè)困擾瓜蔞優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的嚴(yán)重問題。本文僅就生物技術(shù)在栝樓種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為栝樓種質(zhì)資源研究、優(yōu)良種質(zhì)篩選以及優(yōu)良種苗繁育等提供資料。

1 分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記技術(shù)在栝樓種質(zhì)研究中的應(yīng)用處于起步階段，主要集中在隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記 (RAPD)、錨定簡單序列重復(fù)區(qū)間 (ISSR)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (AFLP)等技術(shù)的應(yīng)用。

1.1 RAPD技術(shù)在栝樓種質(zhì)研究中的應(yīng)用 黃璐琦等［18-19］用RAPD標(biāo)記法對山東長清瓜蔞農(nóng)家品種苗期進(jìn)行了研究，使用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取DNA，擴(kuò)增結(jié)果顯示，該方法能明顯區(qū)別瓜蔞的3個(gè)主流農(nóng)家品種;在用該技術(shù)對天花粉及類似品進(jìn)行鑒別的研究中，有效地將26個(gè)樣品分成了三大類。王敏等［20］通過對山東仁瓜蔞、糖瓜蔞、牛心瓜蔞進(jìn)行RAPD標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)牛心瓜蔞與仁瓜蔞的遺傳距離 (0.478 261)最小，牛心瓜蔞與糖瓜蔞的遺傳距離 (0.846 154)最大，這與生產(chǎn)實(shí)踐中瓜蔞質(zhì)量的表現(xiàn)一致。孫稚穎等［21］采用RAPD標(biāo)記技術(shù)，對瓜蔞各農(nóng)家品種、野生瓜蔞和山東誤引種的湖北栝樓的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，仁瓜蔞與牛心瓜蔞、小光蛋與野生瓜蔞、大瓜蔞與牛心瓜蔞親緣關(guān)系較近，而明皮是形似小光蛋的一個(gè)獨(dú)立農(nóng)家栽培品種，地瓜蔞屬于小光蛋的一個(gè)較初級的栽培品種，湖北栝樓與其它各農(nóng)家品種差異顯著。劉亞魯?shù)龋?2］對馬山同一種植基地的7個(gè)性狀特征不同的瓜蔞樣品進(jìn)行了RAPD分析，結(jié)果顯示，7個(gè)瓜蔞樣品的遺傳物質(zhì)之間存在差異，說明在生產(chǎn)實(shí)踐中作為同一種種植的瓜蔞仍可能存在瓜蔞種質(zhì)混亂的危險(xiǎn)。曲益濤等［23］應(yīng)用RAPD和序列特異性擴(kuò)增區(qū)域 (SCAR)分子標(biāo)記技術(shù)成功鑒別未成熟栝樓的性別，以指導(dǎo)生產(chǎn)上合理的雌、雄性植株田間配置以及育種工作［24］。以上實(shí)驗(yàn)說明，栝樓不同品種及品系之間的DNA進(jìn)化速度、變異范圍和遺傳距離可以通過RAPD標(biāo)記進(jìn)行分析，并且取得了與形態(tài)學(xué)和生產(chǎn)實(shí)踐比較一致的結(jié)果。

1.2 ISSR技術(shù)在栝樓種質(zhì)研究中的應(yīng)用 ISSR標(biāo)記技術(shù)能較好的反映物種遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化等，擴(kuò)增特異性、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。曲超等［25］通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，首次建立了栝樓ISSR-PCR分析的最適反應(yīng)體系:20μL的反應(yīng)體系中，1×buffer，模板量為50 ng，引物的濃度為0.5μmol/L，Taq DNA聚合酶的用量為0.8 U，dNTPs(三磷酸脫氧核糖核苷)的濃度為200μmol/L。李慧慧等［26］運(yùn)用正交試驗(yàn)進(jìn)行了更細(xì)致的體系優(yōu)化，結(jié)果表明，20μL的反應(yīng)體系中，DNA模板量為30 ng，MgCl2濃度為2.0 mmol/L，dNTPs濃度為0.3 mmol/L，引物濃度為0.5μmol/L，0.5 U Taq DNA聚合酶;退火溫度為52℃ ～55℃;擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min;4℃保存。高燕會等［27］基于ISSR分子標(biāo)記法，對采自不同種植地區(qū)的34份栝樓種質(zhì)進(jìn)行了多態(tài)性和聚類分析。通過15條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共顯示112條帶，其中101條具有多態(tài)性，占總擴(kuò)增帶數(shù)的90%。結(jié)果顯示，有效的將34份栝樓種質(zhì)分為3大類群3小組。

1.3 AFLP技術(shù)在栝樓種質(zhì)研究中的應(yīng)用 千春錄［28］用AFLP分子標(biāo)記對12份栝樓材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示二倍體材料 (1、2、3號)為第1組，剩下的八倍體材料為第2組;組內(nèi)差異分別由組內(nèi)的明顯分支顯示。孫永剛［29］建立了可以用于栝樓雌雄株鑒別的AFLP反應(yīng)體系，并篩選出了27對可用于栝樓AFLP分析的多態(tài)性引物。由于AFLP標(biāo)記操作復(fù)雜、成本較高［30］，其應(yīng)用受到局限。

2 生化標(biāo)記技術(shù)

目前，同工酶標(biāo)記和貯藏蛋白標(biāo)記在栝樓種質(zhì)研究中比較常用。

2.1 用于親緣關(guān)系的判斷 不同品種、產(chǎn)地栝樓的蛋白電泳圖譜都會出現(xiàn)不同程度的差異［31］。孫稚穎等［32］采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，對山東栝樓農(nóng)家栽培品種、野生種以及湖北栝樓的種子蛋白進(jìn)行了分析。研究表明，山東優(yōu)質(zhì)農(nóng)家品種仁瓜蔞、牛心瓜蔞的種子蛋白電泳譜圖具有明顯的相似性;小光蛋與野生栝樓的蛋白電泳譜圖最相似;湖北栝樓與各山東品種在蛋白電泳圖譜上有明顯差異。這些結(jié)果結(jié)合性狀特征從蛋白水平上說明:仁瓜蔞和牛心瓜蔞屬于優(yōu)質(zhì)品種;小光蛋與野生品種較接近，品質(zhì)稍差;湖北栝樓與栝樓是同科同屬不同組別的物種。

2.2 用于栽培品種的鑒定 同工酶電泳圖譜譜帶發(fā)生多態(tài)性變化，反映了生物在蛋白質(zhì)水平上的多型性，可作為生物遺傳變異的證據(jù)［33］。孫稚穎等［34］以過氧化物酶同工酶及酯酶同工酶分析為手段，以山東栝樓的各農(nóng)家栽培品種以及野生種的幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行了同工酶電泳分析，結(jié)果表明，各農(nóng)家栽培品種間及與野生種之間的酶帶數(shù)量、帶級、位點(diǎn)及活性強(qiáng)度等的差異可作為品種鑒定的依據(jù);根據(jù)其同工酶譜圖的相似程度判斷，牛心瓜蔞與仁瓜蔞，野生栝樓與小光蛋，大瓜蔞、八棱瓜蔞及地瓜蔞彼此間親緣關(guān)系較近，這與貯藏蛋白電泳圖譜相結(jié)合可以更準(zhǔn)確的判斷各品種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

2.3 用于雌雄性別的研究 栝樓種植時(shí)雌、雄比例對瓜蔞的產(chǎn)量起著關(guān)鍵性作用，在雌、雄植株區(qū)分方面生物技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的鑒別方法。于鳳池等［35］對栝樓雌、雄不同器官進(jìn)行過氧化物酶同工酶活性和電泳分析，成熟雌株葉片的過氧化物酶同工酶譜帶比雄株多了第5條譜帶 (Rf=0.643);在成熟器官 (葉片、卷須)中，雌株中的過氧化物酶同工酶活性比雄株強(qiáng)，但在幼嫩器官中兩者差別不大。另有研究表明［29］，雌、雄株的葉片、葉柄、卷須、莖尖的各種同工酶圖譜均存在不同程度差異。過氧化物酶同工酶圖譜分析:葉柄的圖譜中出現(xiàn)了4條相關(guān)譜帶;多酚氧化酶同工酶分析:幼苗葉柄、莖尖圖譜中雄株各出現(xiàn)1條特征譜帶，卷須、葉片、莖尖圖譜中雌株各出現(xiàn)1條特征譜帶。雌雄株的酯酶同工酶圖譜、雌雄株不同部位的同工酶含量也表現(xiàn)出一定的差異性。

3 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記技術(shù)

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記技術(shù)主要是指染色體核型和帶型分析，是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本方法。

3.1 用于物種的鑒定 根據(jù)傳統(tǒng)的理念，栝樓染色體的核型對稱性、隨體大小和數(shù)目等方面的差異可以作為分析栝樓不同基因型材料的親緣關(guān)系及種質(zhì)鑒定的方法。黃璐琦等［36］對國內(nèi)栝樓屬的8個(gè)物種進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和鑒定，發(fā)現(xiàn)了中藥瓜蔞和天花粉的染色體特點(diǎn)為表現(xiàn)為八倍體，二倍體一般不能入藥或甚至有毒副作用;并且，多倍體與器官特化以及地理分布尚未發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的聯(lián)系。

3.2 用于染色體倍數(shù)與次生代謝物質(zhì)相關(guān)性研究 楊福紅等［37］研究了人工誘變不同倍性染色體栝樓的生長發(fā)育及果實(shí)糖、酸含有量變化，結(jié)果表明四倍體栝樓的長勢、葉片中含葉綠素量、果實(shí)中含總糖和總酸的量明顯優(yōu)于二倍體;四倍體栝樓果實(shí)大小、質(zhì)量、結(jié)實(shí)率和百粒重明顯小于二倍體，差異極顯著。黃秋波等［38］以五個(gè)不同產(chǎn)地的9種栝樓品系為實(shí)驗(yàn)材料研究了染色體倍性與物質(zhì)積累之間的關(guān)系，9個(gè)品系中一類是染色體數(shù)目為2，n=6X=66的六倍體，另一類是染色體數(shù)目為2，n=8X=88的八倍體。八倍體栝樓在整個(gè)生長發(fā)育時(shí)期其葉片可溶性糖含量均高于六倍體，在盛花期時(shí)的差異達(dá)顯著水平;二者葉片可溶性蛋白含有量無明顯差異，總體來看，以盛花期為限，之前，六倍體栝樓葉片可溶性蛋白質(zhì)含有量高于八倍體，之后，八倍體栝樓葉片中可溶性蛋白質(zhì)含有量相對更高;八倍體栝樓葉片含葉綠素量都低于六倍體，不同發(fā)育時(shí)期的相對差異幅度為4%～10%。這為栝樓優(yōu)良品種的培育和多倍體育種提供了指導(dǎo)依據(jù)。

4 種苗快繁技術(shù)

4.1 外植體選擇研究 在已有的關(guān)于栝樓試管苗快速繁殖體系［39］和外植體取材研究［40］的基礎(chǔ)上，楊曉伶等［41］以栝樓莖段、葉片、塊莖幼苗的莖尖和帶芽莖段進(jìn)行了快繁外植體選擇研究。結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基+2 mg/L芐氨基腺嘌呤 (BA)+0.5～0.05 mg/Lα-萘乙酸 (NAA)可誘導(dǎo)塊莖幼苗莖尖及帶芽莖段產(chǎn)生叢生芽，在MS培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L吲哚丁酸 (BA)作用下生根，能夠在移栽后實(shí)現(xiàn)快速繁殖，而莖段和葉片可形成愈傷組織，但不能形成根。

4.2 最佳快繁條件研究 余慧琳等［42］通過對莖段腋芽的離體快繁研究，確定了形成無菌試管苗的最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.2～0.3 mg/L BA+0.1～0.2 mg/L NAA組合;繼代增殖最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+0.1 mg/L BA+0.1～0.2 mg/L NAA組合;生根最佳培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基+0.2 mg/L NAA組合。陳惠［43］研究發(fā)現(xiàn)將不定根根尖，接種在MS+4 mg/L BA的培養(yǎng)基上光下培養(yǎng)效果最佳。蘭偉等［44］研究并確定了適宜栝樓芽及愈傷組織誘導(dǎo)、繁殖、生根的最佳培養(yǎng)基條件。有研究［45］對不同激素對栝樓試管苗生根影響進(jìn)行了研究，6-芐氨基腺嘌呤 (6-BA)為1.5 mg時(shí)對芽的誘導(dǎo)效果最好;采用MS培養(yǎng)基附加1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA增殖效果好;IBA比NAA更能促進(jìn)生根。各種最佳條件的確立對于栝樓優(yōu)質(zhì)種苗選育、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)以提取有效成分的研究有著重要意義。

4.3 其它 近年對栝樓細(xì)胞培養(yǎng)、雌雄株組織培養(yǎng)和發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的研究也有報(bào)道［46］，建立起了分散程度較好的栝樓懸浮細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)了雌雄栝樓愈傷組織的分化具有性別差異，培養(yǎng)基也有所不同。寧志怨［47］、丁婷等［48］分別對發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)栝樓組培苗莖段和葉片生根、無菌苗毛狀根發(fā)生進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該種方法可以成功地整合基因，后者發(fā)現(xiàn)LBA9402農(nóng)桿菌對毛狀根的產(chǎn)生誘導(dǎo)率最高，并且毛狀根不定芽最佳分化培養(yǎng)基為 (6-芐基氨基嘌呤)2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L激動(dòng)素+0.5 mg/L NAA。

5 小結(jié)與展望

5.1 分子標(biāo)記技術(shù) 由于分子標(biāo)記技術(shù)在栝樓種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用缺乏任何分子生物學(xué)的研究背景，在研究過程中，要得到具有統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果，必須選擇多達(dá)幾十條，甚至上百條隨機(jī)引物。實(shí)驗(yàn)過程中，PCR這一步驟受到退火溫度等諸多因素的影響，所以各種分子標(biāo)記技術(shù)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性尚有待深入研究。另外，ISSR標(biāo)記在栝樓種質(zhì)研究中的應(yīng)用研究不夠深入，并且各種技術(shù)之間缺乏一定的相互印證。但不可否認(rèn)，分子標(biāo)記技術(shù)在目前栝樓DNA序列尚未清楚的情況下，有著廣闊的應(yīng)用前景;隨著該技術(shù)與經(jīng)典形態(tài)學(xué)相結(jié)合在栝樓種質(zhì)研究中的深入應(yīng)用，可以考慮從堿基水平上進(jìn)行研究，探索DNA序列差異與有效物質(zhì)之間的關(guān)系，不僅使種質(zhì)差異更加具體化，而且可以更加具體的指導(dǎo)良種選育和大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。

5.2 生化標(biāo)記技術(shù) 生化標(biāo)記技術(shù)用于不同品種栝樓的區(qū)分，但產(chǎn)地、生長年限、部位和性別的不同都會使譜圖產(chǎn)生差異。今后在種質(zhì)區(qū)分研究中可以考慮同時(shí)運(yùn)用多種技術(shù)，相互印證，獲得更為穩(wěn)定的結(jié)果;而在栝樓遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化的研究中就要考慮到產(chǎn)地、年限、部位、性別的因素，適時(shí)應(yīng)用。比如，Lata等［49］已將ISSR技術(shù)用于微體繁殖植株的遺傳穩(wěn)定性研究，可以將該技術(shù)用于栝樓優(yōu)良種質(zhì)快繁植株的基因穩(wěn)定性研究，以確保種質(zhì)研究的有效性。

5.3 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記技術(shù) 目前已將栝樓染色體核型分析應(yīng)用于物種進(jìn)化分析［15］和染色體核型與果實(shí)中糖酸積累、植株生長發(fā)育相共性的研究，對優(yōu)良品種的選育發(fā)揮了重要作用。染色體作為遺傳物質(zhì)的載體，具有指導(dǎo)合成生物體內(nèi)各種蛋白質(zhì)、核酸等的遺傳信息，因此，與生物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的形成和積累有著必然的聯(lián)系。細(xì)胞學(xué)標(biāo)記技術(shù)與次生代謝產(chǎn)物相關(guān)性的研究，對于栝樓優(yōu)良種質(zhì)選育和大規(guī)模規(guī)范化種植及細(xì)胞培養(yǎng)有著重要的指導(dǎo)意義。所以，對于栝樓有效物質(zhì)的積累與遺傳物質(zhì)的關(guān)系的研究將會越來越受到大家的重視。

5.4 種苗快繁技術(shù) 栝樓是雌、雄異株植物，種子繁殖極易發(fā)生變異，且雌雄難辨;用分根法繁殖系數(shù)低，使發(fā)展良種生產(chǎn)受到一定限制。利用組織培養(yǎng)法進(jìn)行種苗快繁，具有繁殖系數(shù)高、速度快、成苗率高等優(yōu)點(diǎn)，可作為栝樓良種快速繁殖的有效途徑。人們已經(jīng)對外植體、最佳培養(yǎng)基、激素、細(xì)胞培養(yǎng)、發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根發(fā)生等方面進(jìn)行了研究，建立了多個(gè)快繁體系。為了理順栝樓優(yōu)質(zhì)種苗渠道，尚需將快繁技術(shù)規(guī)范化和規(guī)?；?，才能使現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。

5.5 展望 栝樓種質(zhì)資源研究中尚普遍存在著樣品的有限性問題，需要全面收集全國的栝樓種質(zhì);針對栝樓種質(zhì)豐富、良莠不齊的現(xiàn)狀，可以先通過分子標(biāo)記技術(shù) (主要是ISSR標(biāo)記技術(shù))進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系的研究，進(jìn)而結(jié)合生化標(biāo)記技術(shù)和經(jīng)典形態(tài)學(xué)研究進(jìn)行細(xì)致的品種劃分。在此基礎(chǔ)上，再進(jìn)行有效物質(zhì)和快速繁殖的研究。運(yùn)用生物技術(shù)對栝樓進(jìn)行種質(zhì)研究，順應(yīng)了從分子水平上對中藥材進(jìn)行質(zhì)量控制的趨勢，將對栝樓的質(zhì)量控制、活性成分研究產(chǎn)生不可估量的作用。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010．

［2］陳 勤．中藥美容保健品的研究與開發(fā)［M］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1999:21．

［3］王 曼，史素霞．具有開發(fā)價(jià)值的觀果植物栝樓［J］．北方園藝，2007，31(12):166．

［4］任 靜，何家慶．栝樓子資源的利用及其價(jià)值［J］．中國野生植物資源，2001，20(6):21-22．

［5］高家春．垂直綠化新秀——栝樓［J］．園林科技，2007，(1):21．

［6］胡玉濤，王 沫，肖平闊．應(yīng)用栝樓進(jìn)行郊區(qū)綠化的探討［J］．中國林副特產(chǎn)，2006，(5):81-83．

［7］張龍霏，李 佳，郝 志，等．栝樓種質(zhì)資源與良種選育研究概況［J］．中國現(xiàn)代中藥，2010，12(8):10．

［8］戰(zhàn)晴晴，隋 春，魏建和，等．利用ISSR和SSR分子標(biāo)記構(gòu)建北柴胡遺傳圖譜［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(4):517-523．

［9］許永華，張愛華，金 慧，等．人參種源遺傳關(guān)系的ISSR分析［J］．中草藥，2010，41(7):1164-1167．

［10］張忠廉，李學(xué)蘭，楊春勇，等．砂仁遺傳多樣性的ISSR分析［J］．中草藥，2011，42(3):570-574．

［11］謝果珍，舒少華，王 沫．栝樓不同居群可溶性蛋白質(zhì)和酯酶同工酶電泳分析［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48(2):385-387．

［12］于 晶，陳 君，徐 榮，等．不同種源黃芩的過氧化物同工酶研究［J］．中藥材，2006，29(7):647-649．

［13］陳 黎，吳 衛(wèi)，鄭有良．不同染色體數(shù)目魚腥草揮發(fā)油成分的薄層色譜分析［J］．中草藥，2004，35(12):1399-1402．

［14］余麗瑩，譚小明，周雅琴．兩面針染色體的核型分析［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(12):3284-3285．

［15］王 嵐，劉麗莎，吳 迪，等．麻花秦艽染色體的核型分析［J］．中藥材，2010，33(2):171-173．

［16］李鐵軍，馮建忠，黃麗華，等．泰山四葉參的組織培養(yǎng)與快速繁殖［J］．中藥材，2011，34(11):1667-1671．

［17］劉曉東，單麗輝，李玉珠，等．多葉棘豆組織培養(yǎng)及快速繁殖研究［J］．中藥材，2011，34(11):1661-1663．

［18］黃璐琦，王 敏，楊 濱．瓜蔞農(nóng)家品種苗期的分子標(biāo)識鑒別［J］．中國中藥雜志，1999，39(9):642．

［19］黃璐琦，王 敏，楊 濱，等．用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)技術(shù)鑒別中藥材天花粉及其類似品［J］．藥物分析雜志，1999，19(4):233-237．

［20］王 敏，黃璐琦，付桂芳．栝樓3個(gè)農(nóng)家品種間親緣近似關(guān)系的RAPD分析［J］．中國中藥雜志，1999，24(6):336-337．

［21］孫稚穎，周鳳琴．山東產(chǎn)瓜蔞不同農(nóng)家品種的RAPD研究［J］．中草藥，2006，37(3):26-429．

［22］劉亞魯，李 峰，宋艷梅，等．山東道地藥材瓜蔞7個(gè)樣品的RAPD 分析［J］．山東中醫(yī)雜志，2012，31(3):206．

［23］曲益濤，董 玲，江 芹，等．栝樓的RAPD-PCR體系建立與優(yōu)化［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(13):7150-7152．

［24］曲益濤．栝樓性別轉(zhuǎn)化的RAPD-SCAR標(biāo)記研究［D］．合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010．

［25］曲 超，孫 群，丁自勉，等．栝樓ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化［J］．基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(1):127-131．

［26］李慧慧，朱玉球，斯金平，等．栝樓ISSR-PCR體系的正交優(yōu)化［J］．生物技術(shù)，2009，19(6):38-41．

［27］高燕會，李慧慧，朱玉球，等．給予ISSR的栝樓遺傳多樣性分析［J］．中草藥，2011，42(2):363-366．

［28］千春錄．藥用植物栝樓種質(zhì)資源及多樣性研究［D］．杭州:浙江大學(xué)，2007．

［29］孫永剛．栝樓苗期雌雄株鑒別的研究［D］．合肥:安徽大學(xué)，2007．

［30］李 婷，林文津，徐榕青，等．ISSR技術(shù)在藥用植物種質(zhì)研究中的應(yīng)用［J］．中國民族民間醫(yī)藥(藥物研究)，2010，(1)，41-42．

［31］董婷霞，徐國鈞，金蓉鸞，等．栝樓屬種子類藥材的蛋白電泳鑒別［J］．中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，21(4):249-250．

［32］孫稚穎，周鳳琴，郭慶梅．山東產(chǎn)不同農(nóng)家品種瓜蔞的種子蛋白電泳分析［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005，16(12):1224-1225．

［33］段會軍，張彩英，張麗娟，等．河北省大豆種質(zhì)資源同工酶及RAPD標(biāo)記多樣性研究［J］．中國油料作物學(xué)報(bào)，2003，25(2):15-20．

［34］孫稚穎，李恩波，周鳳琴．山東農(nóng)家栽培瓜蔞品種的同工酶研究［J］．中草藥，2005，28(10):863-865．

［35］于鳳池，孫耘子，袁高峰，等．栝樓性別分化特異大分子標(biāo)記物研究［J］．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，15(6):332-335．

［36］黃璐琦，樂崇熙．栝樓屬8種植物的染色體數(shù)目［J］．云南植物研究，1994，16(1):95-96．

［37］楊福紅，吳玉香，趙曉明．不同倍性栝樓生長發(fā)育及果實(shí)糖酸含量的研究［J］．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24(12):220-224．

［38］黃秋波．不同品系栝樓的生理基礎(chǔ)研究［D］．武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

［39］佟宏霞，李喜文，邢 苗．栝樓組織培養(yǎng)和植株再生研究［J］．中國中藥雜志，1996，21(12):721-722．

［40］陳 惠，梁倩華．栝樓組織培養(yǎng)中植株再生的研究［J］．中草藥，1996，27(12):737-740．

［41］楊曉伶，金關(guān)榮，楊瑞鵬，等．栝樓的組培快繁技術(shù)研究［J］．中藥材，2006，29(11):1129-1130．

［42］余慧琳，胡月華，李 君．栝樓離體快繁的初步研究［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48(2):272-274．

［43］陳 惠．栝樓的根段及根尖培養(yǎng)與器官發(fā)生［J］．山西師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1994，8(1):52-57．

［44］蘭 偉，蔡 健，朱茂英，等．栝樓的組織培養(yǎng)與快速繁殖［J］．植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2006，15(4):73-74．

［45］廖華俊，董 玲，江 芹，等．栝樓組織培養(yǎng)及非試管苗快繁技術(shù)研究［J］．中國瓜菜，2006(3):4-7．

［46］朱蘇文，馬 慶，汪 馨，等．栝樓細(xì)胞懸浮系的建立［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(16):4814-4815．

［47］寧志怨，董 玲，陳靜嫻，等．發(fā)根農(nóng)桿菌對栝樓的遺傳轉(zhuǎn)化［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(14):4142-4143．

［48］丁 婷，馬 慶，項(xiàng) 艷．發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)栝樓毛狀根的研究［J］．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，35(3):436-439．

［49］Lata H，Chandra S，Techen N，et al．Assessment of the genetic stability of micropropagated plants of Cannabis sativa by ISSR markers［J］．Planta Med，2010，76(1):97-100．