羅蘇僅，白衛(wèi)東，2*，趙文紅，2，錢 敏，沈 棚

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是發(fā)酵酒（如葡萄酒、黃酒、清酒）及其他發(fā)酵食品生產(chǎn)過程的一種副產(chǎn)物。1943年，NETTLESHIP A等[1]研究發(fā)現(xiàn)，EC具有一定的致癌性。氨基甲酸乙酯在人體內(nèi)代謝過程中被轉(zhuǎn)化為N-羥基-氨基甲酸乙酯，這種物質(zhì)可誘導(dǎo)Cu2+調(diào)控的DNA損傷[2-4]，引起癌變。人體攝入氨基甲酸乙酯絕大部分是通過飲用酒精飲料，調(diào)查顯示[5]，人們飲用EC含量超過30μg/L的酒后，患癌幾率增加。這些研究引起了國際上對酒精飲料中EC含量的重視。1985年，加拿大政府部門首次對不同酒精飲料中EC的含量制定了強(qiáng)制性限量標(biāo)準(zhǔn)[6]。1988年，美國葡萄酒工業(yè)對葡萄酒中EC含量進(jìn)行了限定[7]。2002年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織制定了國際標(biāo)準(zhǔn)，氨基甲酸乙酯的含量不得超過20μg/L。

目前，我國仍沒有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)對發(fā)酵酒和發(fā)酵食品中的EC含量進(jìn)行限定。發(fā)酵酒中含有豐富的精氨酸，在發(fā)酵過程中可降解產(chǎn)生尿素、瓜氨酸或氨甲酰磷酸。這些物質(zhì)都能與乙醇作用形成氨基甲酸乙酯，降低了發(fā)酵酒的飲用安全性。因此，研究發(fā)酵酒中氨基甲酸乙酯形成的代謝途徑及降低其含量的控制策略，對我國食品安全和酒類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 發(fā)酵酒中氨基甲酸乙酯形成的代謝途徑

發(fā)酵酒中的氨基甲酸乙酯是由前體物質(zhì)（尿素、瓜氨酸等氨甲酰類化合物）和乙醇自發(fā)反應(yīng)產(chǎn)生的。尿素和瓜氨酸在發(fā)酵液中的累積是分別通過酵母菌和乳酸菌對發(fā)酵液中精氨酸代謝的結(jié)果。相關(guān)研究表明，發(fā)酵酒中氨基甲酸乙酯形成的絕大部分源于酵母降解精氨酸的尿素循環(huán)途徑（urea cycle pathway）[8]和乳酸菌的精氨酸脫亞胺途徑（arginine deiminase pathway，簡稱ADI途徑）[9]。

1.1 尿素與乙醇形成氨基甲酸乙酯

尿素和乙醇形成氨基甲酸乙酯的反應(yīng)式如下：

H2NCONH2+C2H5OH→H2NCO2C3H5+NH3

在發(fā)酵酒釀造過程中，尿素的來源主要有2個(gè)方面：發(fā)酵前作為酵母氮源添加到發(fā)酵液中；由酵母菌降解精氨酸生成。在酒精發(fā)酵時(shí)，酵母內(nèi)的精氨酸酶基因（CAR1）處于高表達(dá)階段，大量生成鳥氨酸和尿素。酵母優(yōu)先利用已積累足夠的氮，使得脲基酰胺酶基因（DUR1、2）的起始轉(zhuǎn)錄受到阻遏，遠(yuǎn)低于精氨酸酶基因（CAR1）的表達(dá)，從而導(dǎo)致尿素的進(jìn)一步分解不能及時(shí)進(jìn)行，過量積累的尿素對細(xì)胞具有毒性，因此多余的尿素隨即被分泌到胞外，最終導(dǎo)致發(fā)酵液中的尿素含量大幅增加[10]。添加的尿素和分泌到胞外的尿素在適宜條件下反應(yīng)可能生產(chǎn)氨基甲酸乙酯。OUGH CS等[11]對精氨酸、瓜氨酸、氨、尿素和谷氨酸在葡萄酒發(fā)酵過程中對氨基甲酸乙酯形成的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，由精氨酸分解產(chǎn)生的尿素形成的EC含量遠(yuǎn)多于由氨甲酰磷酸形成的EC含量，由尿素形成的氨基甲酸乙酯是成品葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的絕大部分，因此，尿素是形成氨基甲酸乙酯的主要前體物質(zhì)。黃酒中90%的氨基甲酸乙酯也是由尿素和乙醇反應(yīng)生成的。楊建剛等[12]進(jìn)行了黃酒酵母發(fā)酵過程中產(chǎn)尿素的變化規(guī)律實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，黃酒酵母在生長過程中，分泌大量尿素到胞外，在穩(wěn)定期（培養(yǎng)51h）胞外尿素濃度的38.64mg/L，胞內(nèi)尿素濃度（培養(yǎng)27h）為6.04mg/L。日本研究者采用基因敲除原理構(gòu)建了精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，該清酒發(fā)酵過程中未發(fā)現(xiàn)尿素的累積，并檢出EC含量大幅度下降[13-14]。

1.2 瓜氨酸與乙醇形成氨基甲酸乙酯

瓜氨酸與乙醇形成氨基甲酸乙酯的反應(yīng)式如下：

H2NCONH（CH2）3CH（NH2）COOH+C2H5OH →H2NCO2C2H5+H2N CH2）3CHNH2COOH

發(fā)酵酒在酒精發(fā)酵結(jié)束后，一般要進(jìn)行蘋果酸-乳酸菌（malolactic bacteria，MLB）發(fā)酵。蘋果酸-乳酸發(fā)酵對降低酒的酸度、改善風(fēng)味和增加酒中微生物的穩(wěn)定性方面具有重要意義。而蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中對精氨酸的代謝會導(dǎo)致瓜氨酸的分泌。研究發(fā)現(xiàn)[15]，在未經(jīng)發(fā)酵的新鮮葡萄汁中加入12%vol的乙醇后，未經(jīng)過加熱的葡萄汁中EC含量低于0.1μg/L，經(jīng)過70℃加熱48h后，形成EC的含量為19μg/L～54μg/L。添加酸性脲酶后，并不能有效降低加熱后形成的EC含量。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明尿素并非葡萄汁中形成EC的前體物質(zhì)。葡萄汁中含有的瓜氨酸可以直接和乙醇反應(yīng)，且不受脲酶影響，所以研究者認(rèn)為瓜氨酸可能是葡萄汁中形成EC的前體物質(zhì)。高年發(fā)等[16]在對2種葡萄酒釀造過程中EC的含量進(jìn)行測定，研究發(fā)現(xiàn)，2種葡萄酒在進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵時(shí)都會有新的EC形成。范春艷[17]在研究赤霞珠葡萄酒樣在發(fā)酵過程中EC含量變化規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，在酒精發(fā)酵期間（前7d）變化趨勢并不明顯，但在蘋果酸-乳酸發(fā)酵后期（23d～28d）EC的含量增長速度明顯大于其他時(shí)期的增長速度。

直至20世紀(jì)90年代，MLB發(fā)酵降解精氨酸的途徑存有爭議。KUENSCH U等[18]通過研究瑞士紅葡萄酒在蘋果酸乳酸發(fā)酵過程中精氨酸和鳥氨酸之間的化學(xué)計(jì)量轉(zhuǎn)化關(guān)系，提出了精氨酸代謝是通過尿素循環(huán)途徑的觀點(diǎn)。而LIU SQ等[8]在葡萄酒中進(jìn)行乳酸菌的精氨酸代謝實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，細(xì)菌培養(yǎng)過程沒有尿素的檢出，在細(xì)菌的抽提物中也沒有檢測到精氨酸酶和脲酶的活力，從而否定了KUENSCH U提出的觀點(diǎn)。結(jié)合其他研究者對發(fā)酵食品（如發(fā)酵肉制品[19]）中乳酸菌的精氨酸代謝途徑研究，LIU SQ等[20]提出了乳酸菌的精氨酸脫亞胺途徑（arginine deiminase pathway，簡稱ADI途徑）。在乳酸菌代謝精氨酸過程中存在2個(gè)關(guān)鍵酶：精氨酸脫亞胺酶（arginine deiminase，ADI）、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（ornithinetranscarbamylase，OTC）。方若思等[21]通過研究黃酒發(fā)酵過程中精氨酸代謝酶對氨基甲酸乙酯形成的調(diào)控作用，結(jié)果表明，低濃度抑制劑L-鳥氨酸鹽酸鹽的添加有利于瓜氨酸積累，從而激發(fā)OTC酶表達(dá)，酶解瓜氨酸速度加快直接導(dǎo)致EC生成量降低。

2 降低發(fā)酵酒中氨基甲酸乙酯含量的控制策略

發(fā)酵酒中EC的形成主要來源于尿素或瓜氨酸與乙醇的反應(yīng)。為了降低發(fā)酵酒中EC的含量，目前國內(nèi)外普遍采用的思路是降低發(fā)酵液中EC的主要前體物質(zhì)的含量，從而達(dá)到降低EC生產(chǎn)的目的。結(jié)合現(xiàn)有的文獻(xiàn)和資料，主要采取的有效控制策略如下：選育低產(chǎn)尿素的酵母；添加酸性脲酶；直接去除EC。

2.1 低產(chǎn)尿素酵母的選育

根據(jù)尿素循環(huán)途徑，有2條構(gòu)建低產(chǎn)尿素酵母的思路：1）切斷由CAR1基因編碼的精氨酸酶，弱化精氨酸分解生成尿素。2）強(qiáng)化由DUR1、2基因編碼的尿素降解途徑，促進(jìn)尿素的降解。

針對弱化精氨酸酶的思路，KITAMOTO K等[22-23]利用同源重組原理敲除2個(gè)CAR1的等位基因構(gòu)造精氨酸酶基因（CAR1）缺陷型，獲得低產(chǎn)尿素的清酒酵母。經(jīng)該菌株釀造的清酒，EC含量大幅下降，而且酒液即便經(jīng)過6個(gè)月的儲存，EC含量也無上升。日本研究者分別利用紫外線照射和化學(xué)誘變方法成功地篩選到了CAR1基因發(fā)生突變的低產(chǎn)尿素的清酒酵母菌株[24-25]；王德良等[26]最近通過He-Ne激光和亞硝基胍復(fù)合誘變法篩選得到了一株CAR1突變型的低產(chǎn)尿素黃酒酵母菌株，利用該突變株進(jìn)行黃酒的發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)顯示，發(fā)酵液中尿素含量下降了52.15%。

尿素降解途徑的強(qiáng)化也是目前選育低產(chǎn)尿素菌株的研究熱點(diǎn)。2010年，DAHABIEH MS等[27]以日本清酒常用工業(yè)酵母菌株K7和K9為改造對象利用“自克隆技術(shù)”構(gòu)建了低產(chǎn)尿素工程菌株K7EC-和K9EC-，清酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，K7EC-和K9EC-較出發(fā)菌株EC含量分別下降了87%和68%[27]。2012年，朱旭亞[28]通過同源重組方式將DUR1、2基因整合到黃酒酵母基因組中，獲得菌株85DUR1、2，再將其和出發(fā)菌85#進(jìn)行黃酒釀造實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，酒體中的尿素和EC含量分別比出發(fā)菌株降低了69%和41%。

構(gòu)建精氨酸酶基因缺失的釀酒酵母可從源頭上解決酒液中的EC問題，但此策略的缺陷是由于精氨酸是酵母發(fā)酵時(shí)利用的重要氮源，因此酵母精氨酸酶基因的缺失可能會導(dǎo)致酵母的發(fā)酵力有所減弱，影響發(fā)酵速度。且研究所構(gòu)建的基因工程使用了抗生素基因標(biāo)記，不具備食品安全性，因此在實(shí)際生產(chǎn)中并未得到應(yīng)用。通過強(qiáng)化尿素降解的途徑也是從源頭上控制EC的生成，且不影響酵母的精氨酸代謝，生成的多余產(chǎn)物（氨和二氧化碳）被直接利用或擴(kuò)散至胞外，對酵母的生長和繁殖影響非常小。雖然各種低產(chǎn)尿素酵母都已有成功篩選的文獻(xiàn)報(bào)道，其生產(chǎn)應(yīng)用尚需考慮發(fā)酵性能的保持、工藝條件的適應(yīng)性、酒體風(fēng)格的獨(dú)特性、繼承性[28]等方面，需進(jìn)行進(jìn)一步的探討研究。

2.2 添加酸性脲酶

在發(fā)酵完全的酒液中添加外源酸性脲酶可使尿素及時(shí)分解為氨和二氧化碳，從而達(dá)到減少EC生成的目的[29]。此方法操作簡單、方便，不改變原釀造酒的菌種和生產(chǎn)工藝，就可以有效的降低酒中氨基甲酸乙酯的含量。

日本的Takeda化學(xué)工業(yè)公司在一種發(fā)酵乳酸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了能有效地分解葡萄酒中的尿素酸性脲酶[30]。有日本的研究者在含有3.5×10-6g/L尿素的酒液中添加5mg酸性尿酶，先在15℃保溫2d，然后在30℃保溫14h，結(jié)果表明，尿素的分解率為100%，且在酒貯藏過程中不會產(chǎn)生EC[31]。周建弟等[32]用酸性脲酶降解黃酒中的尿素，當(dāng)酒體pH＞4.0，溫度15℃～20℃，酶用量30mg/L左右時(shí)，作用48h后，可去除黃酒中約80%的尿素。

此方法的缺點(diǎn)是應(yīng)用成本較高，并且應(yīng)用效果受到酒種等因素的影響（包括脲酶的添加量、反應(yīng)溫度，還有酒液的pH值、氟化物、蘋果酸鹽、乙醇和酚類化合物等[33]）；添加酸性脲酶后，一般需要作用一定時(shí)間后才能確保尿素的充分分解，從而導(dǎo)致酒的生產(chǎn)周期延長。目前，國內(nèi)還不具有開發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)的高活力酸性脲酶制劑，一些釀酒企業(yè)使用酒用酸性脲酶仍需要依靠進(jìn)口。

2.3 直接去除EC

EC降解酶能直接將酒中的EC降解為氨、二氧化碳和乙醇，是一條方便快捷的直接解決EC問題的途徑。EC降解酶應(yīng)用的挑戰(zhàn)主要是其耐酸及耐醇性能。趙雅敏[34]通過分離篩選實(shí)驗(yàn)得到一株具有EC降解能力的菌株LBMAE-8，并對其產(chǎn)生的EC降解酶進(jìn)行初步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過初步純化的酶反應(yīng)溫度為40℃，在酸性條件下酶活力損失嚴(yán)重。通過細(xì)胞固定化后LBMAE-8對乙醇及酸有一定的耐受性，對2種市售黃酒中EC的去除率可達(dá)39.7%與19.0%。徐巖等[35]發(fā)明利用具有生物降解EC功能的固定化膠紅酵母CGMCCNO：5081全細(xì)胞和經(jīng)改造復(fù)配的樹脂材料的吸附作用，對葡萄酒中的EC進(jìn)行處理，EC的去除率可達(dá)91.07%。劉俊[36]研究從各種吸附性材料中優(yōu)選得材料L直接去除黃酒中EC的技術(shù)，經(jīng)酒樣的特殊工藝微調(diào)處理，EC去除率達(dá)到80%以上，同時(shí)對酒體風(fēng)味影響較小。林文浩等[37]通過在黃酒中添加0.8%～1.0%自主研制的黃酒特種助劑，在室溫條件下攪拌60min，然后靜置24h，結(jié)果表明，EC的去除率為42.0%～68.4%，酒體的風(fēng)味口感及主要理化指標(biāo)基本保持不變。對EC的進(jìn)行直接去除，操作簡便，不需更換酵母菌種和不改變生產(chǎn)工藝條件，有利于保持原酒風(fēng)味特性。

3 展望

氨基甲酸乙酯在發(fā)酵酒中廣泛存在，對人類的健康造成了潛在威脅，應(yīng)對發(fā)酵酒中氨基甲酸乙酯的含量加以嚴(yán)格限制。黃酒是世界最古老的三大發(fā)酵酒之一，是我國特有的傳統(tǒng)酒種。我國黃酒中EC含量較高，而各黃酒生產(chǎn)企業(yè)缺乏有效手段對黃酒中EC含量進(jìn)行控制。目前，針對黃酒中EC存在的問題，各高校已進(jìn)行了EC的測定，前體物尿素的測定，酸性脲酶的開發(fā)、應(yīng)用等各個(gè)方面的前期研究工作，但對黃酒發(fā)酵過程中EC形成的代謝機(jī)制仍不十分清楚，需要進(jìn)行深入的研究。關(guān)于葡萄酒和清酒EC代謝調(diào)控的研究證明，可從酶學(xué)基礎(chǔ)上對EC形成進(jìn)行控制。因此，有必要開展在黃酒發(fā)酵及貯藏過程中EC的形成代謝規(guī)律進(jìn)行解析，從而提出適合于我國黃酒中氨基甲酸乙酯控制的最優(yōu)策略。

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