李姝睿，牛春華，劉新鳳，李 達(dá)，周宏璐，王景會(huì)*

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033)

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是美國(guó)食品及藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）及我國(guó)衛(wèi)生部都認(rèn)定的安全菌種，更是當(dāng)今工業(yè)酶的主要生產(chǎn)菌種之一[1]，主要用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶[2]。尤其近年來(lái)的研究表明，其分泌的生物酶在玉米的生物改性中將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[3]。

淀粉及蛋白質(zhì)是玉米粉的主要成分，蛋白質(zhì)中氨基酸組成的變化及淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉的數(shù)量、比例等都對(duì)玉米粉的食用及加工品質(zhì)有重要影響[4]。實(shí)驗(yàn)主要研究了枯草芽孢桿菌胞外酶修飾改性前后玉米粉顆粒形態(tài)、結(jié)晶類(lèi)型、淀粉及氨基酸的變化，以便于進(jìn)一步探討枯草芽孢桿菌胞外酶對(duì)于玉米粉修飾改性的原因及作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米粉：普通黃色凹齒玉米粉，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

蛋白胨、酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉：北京化工廠；鹽酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-X100全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；Evolution RC高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Stovall公司；WYT-32型手持式糖度計(jì)：泉州光學(xué)儀器廠；Varian Cary 300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：澳大利亞PTY電器有限公司；JJ200電子天平：美國(guó)雙杰公司；DHC-9023A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；S-433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀：德國(guó)Sykam公司；JSM-6700F掃描電鏡：日本Sanyo公司；XRD X-射線衍射儀：日本Rigaku Radiation Shield公司。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢桿菌胞外酶對(duì)玉米粉的修飾改性

取在（Luria-Bertani，LB）瓊脂平板上活化的枯草芽孢桿菌，接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)20h后離心，上清即為胞外粗酶液。然后，在上清液中加入10%的玉米粉（w/v）振蕩處理10h取出，4℃、8000r/min離心10min，去上清，沉淀于45℃烘干粉碎，過(guò)100目篩待用。

1.3.2 生物酶修飾對(duì)于玉米淀粉顆粒形態(tài)的影響

將待測(cè)玉米粉樣品均勻分布在粘有導(dǎo)電雙面膠的樣品臺(tái)面上，真空條件下噴上一層鉑金，然后固定于載物臺(tái)上，在掃描電鏡上觀察淀粉顆粒的形態(tài)。

1.3.3玉米淀粉顆粒的X-射線衍射分析

采用粉末衍射法測(cè)定，分析測(cè)試條件設(shè)定為：特征射線CuKα，管流40mA，管壓40kV，掃描速度12°/min，掃描范圍2θ＝0°～80°。

1.3.4 淀粉，直鏈淀粉，支鏈淀粉含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取玉米粉樣品0.1000g，加入10mL0.5mol/LKOH，將上述燒杯置于60℃水浴中保溫10min，并充分?jǐn)嚢?，然后用蒸餾水定容至50mL，搖勻，靜置20min。取2.5mL上清，加入蒸餾水30mL，用0.1mol/L HCl將溶液pH值調(diào)至3.5，然后加入0.5mL碘試劑，最后用蒸餾水定容至刻50mL，靜置30min，分別測(cè)定其吸光度值。

1.3.5 可溶性糖的測(cè)定

采用蒽酮法測(cè)定[5]。

1.3.6 還原糖的測(cè)定

采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定[6]。

1.3.7 糊精的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取玉米粉樣品0.5g，加入5mL蒸餾水，攪拌均勻。50℃恒溫水浴中保溫20min，確保還原糖充分浸出，4℃、5000r/min離心10min，取1mL上清液，緩慢加入8mL 95%vol的乙醇，室溫放置16h以上促使糊精沉淀。4℃、5000r/min離心8min，棄上清，沉淀加入蒸餾水10mL并攪拌均勻，然后加入1mL濃鹽酸，121℃高壓蒸煮30min，促使糊精基本上都水解為葡萄糖。冷卻至室溫后，用20%NaOH溶液中和，定容至15mL，然后依照上述還原糖的測(cè)定方法測(cè)定葡萄糖含量。

1.3.8 玉米粉中氨基酸的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[7]中飼料氨基酸的測(cè)定方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米淀粉顆粒的電鏡觀察

淀粉顆粒的大小、形狀與其來(lái)源密切相關(guān)[8]，也影響著淀粉的功能。如小顆粒淀粉由于具有較大的表面積，消化速率就要快于大顆粒淀粉[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，破碎對(duì)于谷物淀粉顆粒的破壞程度極低，不足0.5%。圖1為生物酶修飾前后玉米淀粉顆粒形態(tài)的電鏡照片，可以看到玉米淀粉顆粒呈多邊形，表面光滑。經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌胞外酶修飾后，淀粉顆粒表面形成明顯酶作用后的孔洞，顆粒整體絕大部分依然保持完整，說(shuō)明酶的修飾并沒(méi)有引起淀粉顆粒崩潰，而是破壞玉米粉顆粒的表面結(jié)構(gòu)，然后滲入淀粉顆粒內(nèi)部[11]，通過(guò)改變淀粉的分子結(jié)構(gòu)，分子取向等發(fā)生作用，進(jìn)而改變玉米粉的品質(zhì)[12-13]。

2.2 生物酶修飾改性玉米粉的X-射線衍射測(cè)定

X-射線是一種波長(zhǎng)很短（約為（20～0.06）×10-8cm）的電磁波，當(dāng)X-射線與物質(zhì)相遇時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列的效應(yīng)，任何一種結(jié)晶的固體化合物由于該物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的不同，都能夠得到一套衍射峰位置及衍射強(qiáng)度完全不同的特征X-射線衍射圖，這些衍射數(shù)據(jù)提供了該晶體許多的信息，如物相的定量、定性分析，晶體粒度大小和晶格的畸變等。目前，X-射線衍射分析已經(jīng)成為研究晶體最方便、最重要的手段[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。原玉米粉對(duì)照及各種微生物胞外酶修飾的玉米粉，基本都是在15°2θ及23°2θ附近位置分別有一個(gè)單的吸收峰，且在17°2θ和18°2θ附近位置有相連的雙峰，這些均為A型晶體的特征吸收峰，說(shuō)明生物酶的修飾并沒(méi)有改變淀粉顆粒的晶體類(lèi)型。

圖1 微生物胞外酶修飾前(A)后(B)玉米粉中淀粉顆粒的電鏡觀察(2000×)Fig.1 Electronic microscope of corn starch particles before(A)and after(B)the modification by exocellular enzymes(2000×)

圖2 生物酶處理前(A)后(B)玉米粉中淀粉顆粒的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffraction pattern of corn starch particles before(A)and after(B)the modification by exocellular enzymes

2.3 枯草芽孢桿菌胞外酶處理對(duì)玉米粉中淀粉及糖類(lèi)的影響

玉米淀粉顆粒是由支鏈淀粉和直鏈淀粉2種高分子有序集合而成的，淀粉的組成即支鏈淀粉與直鏈淀粉的比例及直鏈淀粉的含量，對(duì)玉米粉的品質(zhì)有很重要的影響[15]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，枯草芽孢桿菌處理后玉米粉中淀粉和支鏈淀粉含量下降明顯，分別由對(duì)照組的70.72%、53.41%下降為酶修飾后的46.82%和27.51%，降幅分別為33.78%和48.49%。而直鏈淀粉的相對(duì)含量略有增加，由對(duì)照組的17.41%上升為酶修飾后的19.31%，增幅為10.91%，這可能是由于枯草芽孢桿菌分泌的淀粉酶絕大部分是α-淀粉酶，主要作用于支鏈淀粉，導(dǎo)致淀粉和支鏈淀粉的含量驟減，而直鏈淀粉變化不大，所以相對(duì)含量略有增加，也可能是干物質(zhì)減少所造成的濃縮效應(yīng)。閔偉紅等[16]通過(guò)對(duì)乳酸菌發(fā)酵大米淀粉的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵后大米淀粉中的直鏈淀粉含量增加，支鏈淀粉被降解，與本研究的結(jié)果類(lèi)似?？莶菅挎邨U菌分泌的淀粉酶可以將玉米粉中的淀粉分解成可溶性糖，由圖4可知，隨著淀粉的分解，枯草芽孢桿菌胞外酶修飾產(chǎn)物中可溶性糖含量由對(duì)照的12.33%上升為31.02%，增幅為151.58%；還原糖含量由對(duì)照的4.31%上升為9.22%，增幅為113.92%；糊精含量由對(duì)照的4.01%上升為12.81%，增幅為219.45%。

圖3 枯草芽孢桿菌胞外酶處理前后玉米粉中淀粉組成的變化Fig.3 The change of starch components of corn flour before and after the modification by exocellular enzymes

2.4 枯草芽孢桿菌胞外酶處理前后玉米粉中氨基酸的變化

玉米粉經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌胞外酶修飾后，氨基酸的變化見(jiàn)表1，總氨基酸含量比對(duì)照增加了26.46%。其中，谷氨酸的含量增加比例最大，為84.57%，其次是酪氨酸增加了50%，賴氨酸增加了47.37%，丙氨酸增加了35.42%，纈氨酸增加了34.29%，苯丙氨酸增加了20.51%，異亮氨酸增加了13.79%，而精氨酸下降了28.57%。其余的氨基酸變化較小或基本上沒(méi)有變化。在帶有“*”的必需氨基酸中，僅有精氨酸的相對(duì)含量明顯下降，其他7種都有所增加，賴氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸的相對(duì)含量增加都達(dá)到20%以上。

表1 枯草芽孢桿菌處理前后玉米粉中氨基酸含量的變化Table 1 The change of amino acids contents of corn flour beforeand after the modification by exocellular enzymes

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌胞外酶對(duì)于玉米粉的修飾，只是破壞了其表面結(jié)構(gòu)，在淀粉顆粒表面造成明顯的孔洞，并沒(méi)有引起淀粉顆粒完全崩潰。同時(shí)，也沒(méi)有改變淀粉顆粒的結(jié)晶類(lèi)型。

玉米粉經(jīng)過(guò)枯草芽孢桿菌胞外酶修飾后，其可溶性糖、還原糖及糊精含量都有顯著增加。而總淀粉和支鏈淀粉含量下降明顯，直鏈淀粉的相對(duì)含量略有增加。在氨基酸方面也是變化明顯，尤其是8種必需氨基酸中，除精氨酸外，其余都是有所增加，這些改變對(duì)于玉米粉及其制品食用及加工品質(zhì)的影響都還有待于進(jìn)一步研究。

[1]SHIKHA,SHARAN A,DARMWAL N S.Improved production of alkaline protease from a mutant of alkalophilicBacillus pantotheneticususing molasses as a substrate[J].Bioresource Technol,2007,98(4):881-885.

[2]牛春華，高 巖，李玉秋，等.紫外誘變選育高產(chǎn)蛋白酶枯草芽孢桿菌[J].中國(guó)釀造，2011，30（12）：67-69.

[3]MARCUS S,SINGH A,WARD O P.Developments in the use ofBacillusspecies for industrial production[J].Can J Microbiol,2004,50(1):1-17.

[4]SERAP O,DAVID S J.Functionality behavior of raw and extruded com starch mixtures[J].Cereal Chem,2005,82(2):223-227.

[5]寧正祥.食品成分分析手冊(cè)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.

[6]趙 凱，徐鵬舉，谷廣燁.3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量的研究[J].食品科學(xué)，2008，29（8）：534-536.

[7]閆亞婷.固態(tài)發(fā)酵玉米條件的優(yōu)化及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化的比較研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2010.

[8]SAHLSTROM S,BRATHEN E,LEA P,et al.Influence of starch granule size distribution on Bread characteristics[J].J Cereal Sci,1998,28(2):157-164.

[9]CARCEA M,CUBADDA R,ACQUISTUCCI R.Physiochemical and rheological characterization of sorghum starch[J].J Food Sci,1992,57(4):1024-1028.

[10]吳 俊，謝守和.玉米淀粉的粒度效應(yīng)及其糊化行為影響研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2006，21（1）：51-54.

[11]章華偉.蕎麥淀粉的加工工藝、特性及其改性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)博士論文，2003.

[12]曾 潔.玉米面粉面團(tuán)品質(zhì)特性及加工改良方法的研究[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2007.

[13]魯戰(zhàn)會(huì).生物發(fā)酵米粉的淀粉改性及凝膠機(jī)理研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2002．

[14]張國(guó)權(quán).蕎麥淀粉理化特性及改性研究[J].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)博士論文，2007.

[15]SERAP O,DAVID S J.Functionality behavior of raw and extruded com starch mixtures[J].Cereal Chem,2005,82(2):223-227.

[16]閔偉紅.乳酸菌發(fā)酵改善米粉食用品質(zhì)機(jī)理的研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)博士論文，2003.