劉德海，解復紅，賈 彬，權淑靜，馬 煥，劉金剛

（1.河南省科學院 生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術研究中心，河南 鄭州 450008；3.河南農業(yè)大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002）

β-葡萄糖苷酶亦稱纖維二糖酶，能夠水解β-D-葡萄糖苷鍵。β-葡萄糖苷酶在食品工業(yè)很多方面得到應用，可作為特殊的風味酶應用于改良果汁風味[1]、果酒增香[2]、茶葉增香等方面[3]，能起到較好的增香效果。β-葡萄糖苷酶還可應用于生產大豆異黃酮活性苷元[4]，其能使大豆異黃酮苷等生物苷類物質脫去糖基，變成分子量較小的高生物活性苷元，進而提高生物利用率。據報道，豆奶中添加β-葡萄糖苷酶或接種產β-葡萄糖苷酶的微生物，都能夠將豆奶及豆奶粉中生物有效性較低的異黃酮糖苷化合物高效轉化為高活性的異黃酮苷[5]。此外，利用β-葡萄糖苷酶法生產的龍膽低聚糖可預防食品中的淀粉老化和保持食品中的水分，具有增味作用和顯著的保健功能，這種酶法生產龍膽低聚糖具有反應條件溫和、菌種安全、污染性小、成本低廉、易于分離等優(yōu)點，是生產龍膽低聚糖的主要研究方向[6]。

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界各種微生物中，在一些動植物體內也有分布，在微生物來源方面，主要研究集中在酵母、細菌、霉菌等，而其中對曲霉和康氏木霉研究較多[7]。黑曲霉不產生毒素，是公認的安全微生物[8]，且產胞外β-葡萄糖苷酶。本研究從釀造公司釀造磚曲中分離、篩選得到一株能高效生產β-葡萄糖苷酶的菌株，經菌株形態(tài)觀察和分子生物學鑒定將該菌株初步鑒定為黑曲霉菌（Aspergillus niger）。1材料與方法

1.1 材料與試劑

釀造磚曲，河南省伏陳醋業(yè)有限公司提供。

TaqDNA聚合酶、dNTP購于寶生物工程大連有限公司；Marker、DL2000購于上海萊楓生物科技有限公司；Tris平衡酚購于北京索寶萊科技有限公司；水楊苷購于北京博奧拓科技有限公司；纖維二糖購于美國Amresco公司；羧甲基纖維素鈉購于美國Sigma公司產品；3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）購于軍事醫(yī)學科學院藥材供應站；鏈霉素購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

QYC-2102C全溫培養(yǎng)搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；PHSJ-3F酸度計：瑞士Mettler Toledo公司；DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；T6新世紀紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-16B離心機：上海安亭科學儀器廠；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；SW-CT-ICU超凈工作臺：上海博訊實業(yè)有限公司；UPWS超純水器：杭州永潔達凈化科技有限公司；YP2102電子天平：上海光正醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 菌株保藏培養(yǎng)基

Czapek’s瓊脂培養(yǎng)基：NaNO33.0g，KCl0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，蔗糖30.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH6.0～6.5。

1.3.2 菌株活化培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：取洗凈去皮、挖去芽眼的馬鈴薯200g，切成片狀或絲狀，加水1000mL，煮沸15min，用紗布過濾，加20g瓊脂、20g葡萄糖，再加熱使其溶化，補水至體積為1000mL。

1.3.3 富集培養(yǎng)基

酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，蒸餾水1000mL，pH7.0，加入適量鏈霉素（含鏈霉素30U/mL）。

1.3.4 纖維二糖固體平板分離培養(yǎng)基[9]

（NH4）2SO44.0g ，NaCl 2.0g，CaCO34.0g，KH2PO41.0g，纖維二糖5.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，加入適量鏈霉素。

1.3.5 纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基

CMC-Na 2.0g，（NH4）2SO42.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，pH值7.0，鏈霉素適量。

1.3.6 液體搖瓶發(fā)酵產酶培養(yǎng)基

麩皮3g，NH4NO30.5g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.04g，CaCl20.05g，FeSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水100mL。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種分離純化方法

多點取樣四分法處理后，無菌操作條件下稱取釀造磚曲樣品適量，使之懸浮在無菌水中，振蕩10min～15min，然后加入盛有富集培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、180r/min搖床培養(yǎng)3d左右。培養(yǎng)好的富集培養(yǎng)液1.0mL分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，分別吸取10-4、10-5和10-6稀釋度的稀釋液0.1mL，于菌株活化培養(yǎng)基平板上，立即用無菌玻璃刮板進行平板涂布，然后倒置在恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，于28℃～30℃培養(yǎng)3d～5d左右，挑取長勢較好的真菌菌落采用平板劃線分離法重復以上操作，直至平板上出現單菌落，轉接入菌株固體斜面保藏培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，4℃保藏備用。

1.4.2 菌株的篩選[9]

選取上述分離純化后所得的菌株，用無菌水洗下斜面真菌菌落孢子，適當稀釋后混合置于纖維二糖固體分離培養(yǎng)基平板上，于28℃～30℃培養(yǎng)，待長出菌落后，再轉接于纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基平板上，于28℃～30℃培養(yǎng)3d～5d左右，觀察有無透明圈及透明圈大小，挑取能夠在纖維二糖固體分離培養(yǎng)基平板上生長，且在纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基平板上有明顯透明圈的菌種，轉接入液體搖瓶發(fā)酵產酶培養(yǎng)基進行產酶實驗復篩，培養(yǎng)條件為30℃，180r/min的搖床培養(yǎng)3d后，進行β-葡萄糖苷酶酶活力檢測分析。

1.4.3 形態(tài)學觀察[10]

將所分離菌株在PDA培養(yǎng)基上適當稀釋后培養(yǎng)，獲得單菌落，觀察其菌落形態(tài)；并利用顯微鏡觀察菌絲的特征。

1.4.4 分子生物學鑒定

（1）真菌總DNA的提取[11]

真菌總DNA的提取采用溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法，具體步驟如下：①用無菌解剖刀從培養(yǎng)皿中刮取菌絲0.1g～0.2g至1.5mL離心管中；②加入等體積的滅菌石英砂和200μL、65℃浴熱后的2%CTAB抽提液（CTAB 4g，無水乙醇5mL，蒸餾水100mL，加熱溶解，依次加入56mL的5mol/L NaCl、20mL的1mol/L pH 8.0的Tris-HCl、8mL的0.5mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），用蒸餾水定容至200mL搖勻，經高壓滅菌，冷卻后加入2mL的1%2-巰基乙醇，4℃保存），用無菌研磨棒研磨至勻漿；③加入400μL、65℃預熱的CTAB抽提液，顛倒混勻后于65℃水浴0.5h～1.0h；④冷卻至室溫后，12000r/min離心10min，取上清液至另一離心管中；⑤加入1/2體積的Tris飽和酚（pH 8.0）及1/2體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），顛倒混勻后靜置至其開始分層；⑥12000r/min離心10min，取其上清液至另一離心管中；⑦重復5～6步2～3次，視兩相界面處雜質的多少而定；⑧加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），輕輕顛倒混勻；12000r/min離心10min，取上清液至另一離心管中；⑨向上清液中加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻后于-4℃或-20℃沉淀1h；12000r/min離心10min，棄上清液，加入500μL、70%vol乙醇懸浮沉淀；⑩12000r/min離心5min，棄上清液，室溫干燥；加50μL無菌水或TE（10mmol/L Tris-HCl 1mmol/L EDTA）緩沖液溶解沉淀，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

（2）18S rDNA基因的PCR擴增

在50μL PCR反應體系中依次加入以下試劑：雙蒸水（dd H2O）37.0μL；10×擴增緩沖液5.0μL；d NTP 2μL；上游引物2μL；下游引物2μL；TaqDNA聚合酶0.6μL；提取的真菌模板基因組DNA 2μL，反應總體積為50μL。

擴增18S rDNA基因的引物片段為北京六合華大基因公司提供的通用真菌引物，上游引物ITS1：5’-TCCGTAGG TGAA CCTG CGG-3’和下游引物ITS4：5’-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3’。

PCR擴增條件：94℃預變性4min，94℃預變性30s，56℃預退火30s，72℃預延伸60s，30個循環(huán)，72℃預延伸10min。

PCR擴增產物電泳分析：PCR反應結束后，取6μL擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用電壓170V，電泳時間30min，加溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色15min后，用清水洗脫，然后置于BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)下觀察其電泳條帶。

（3）測序及序列分析

18S rDNA基因的PCR擴增產物經檢測出現明顯電泳條帶后，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，將測序結果基因序列提交到GenBank核酸序列數據庫中與已有的相關同源序列BALST比對分析，Clustal W程序進行多序列比對后，利用MEGA 3.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.5β-葡萄糖苷酶活力的測定方法[12]

β-葡萄糖苷酶活力的測定采用DNS法：取一支25mL的比色管，加入1.0mL 1%的水楊酸溶液（pH值為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制），于50℃水浴中熱2min～3min，加入適當稀釋酶液（發(fā)酵酶液12000r/min離心10min，取上清液）1.0mL，50℃保溫30min，反應結束后立即取出加入3.0mL 3，5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴煮沸5min顯色冷卻后定容至25mL，于波長530nm處測定OD值。另取一支比色管加入1%水楊酸溶液1.0mL，先加入3，5-二硝基水楊酸溶液3.0mL，再加滅活酶液1.0mL，作為空白對照，操作同上。

酶活力定義：在上述反應條件下，以1min內催化底物水解生成1μg還原糖（葡萄糖）所需的酶量定義為一個酶活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 分離篩選結果

對不同的真菌菌株進行分離純化，共得到33支菌株斜面。經纖維二糖固體分離培養(yǎng)基平板與纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)初篩，得到9株既能在纖維二糖固體分離培養(yǎng)基平板上生長且在纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基平板上有明顯透明圈的菌株。再經液體搖瓶發(fā)酵產酶培養(yǎng)基進行產酶實驗，獲得3株有較好β-葡萄糖苷酶生產能力的菌株，然后經發(fā)酵和多次傳代，發(fā)現R16菌株穩(wěn)定性較好，其遺傳穩(wěn)定性見圖1，確定該菌株進行實驗。R16菌株在纖維素-剛果紅平板上產生的水解圈見圖2。

圖1 菌株R16遺傳穩(wěn)定性Fig.1 Genetic stability of strain R16

圖2 R16菌株在纖維素-剛果紅平板上的水解圈Fig.2 Hydrolysis circle of R16 on CMC plate

2.2 菌株R16的形態(tài)特征

菌株R16在Czapek’s瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后，直徑達1.5cm～3.0cm，其形態(tài)特征見圖3。在菌落中心初為白色菌絲絨毛狀凸起，隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸成淺黃色，最后變成褐黑色，產生大量褐黑色孢子，呈厚絨狀，色澤均一，無雜色，菌落不透明，無光澤，無滲出物，邊緣不整齊可見少量白色絲狀菌絲，背面與培養(yǎng)基結合緊密，無色，不分泌色素，有放射狀飾紋。

圖3 R16菌株的菌落形態(tài)Fig.3 Colonial morphology of strain R16

菌株R16在高倍鏡下的形態(tài)見圖4。菌絲透明，有分支和橫隔，有足細胞，分生孢子呈球形或接近球形，呈褐色，分生孢子頭的頂囊呈球形或接近球形，分生孢子著生于分生孢子梗頂囊表面。從菌落、菌絲及孢子形態(tài)觀察可以看出，根據魏景超[10]《真菌鑒定手冊》及相關文獻有關報道，初步將菌株R16鑒定為黑曲霉菌（Aspergillus niger）。

2.3 菌株R16的分子生物學鑒定

2.3.1 菌株R16的18S rDNA基因的獲得

圖5 R16菌株18S rDNA的PCR電泳結果Fig.5 Electtrophresis PCR amplification ITS sequence from strain R16

用ITS1、ITS4真菌通用引物，以提取的該菌基因組為模板進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測的條帶在500bp～700bp，結果見圖5。

2.3.2 菌株R16的18S rDNA的序列分析

測序后，對得到的序列圖譜進行分析，從圖譜中可以看出測序結果沒有雜峰和套峰，說明測序結果真實可靠，去除載體引物序列拼接處理后，得到完整的18S rDNA的基因序列，其測序序列片段長度為572bp，具體序列見表1。

表1 R16菌株18S rDNA序列Table 1 18S rDNA gene sequence of strain R16

2.3.3 R16菌株18S rDNA基因系統(tǒng)進化樹

圖6 菌株R16的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain R16

將測序結果基因序列提交到GenBank核酸序列數據庫中與已有的相關同源序列BALST比對分析，結果表明，R16菌株18S rDNA基因序列與GenBank中已有的黑曲霉菌（Aspergillus niger）相似性都在99%，親緣關系最近，并在18S rDNA基因序列同源性基礎上構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖6。結合R16菌株形態(tài)特征觀察，表明該菌株為黑曲霉屬（Aspergillus）黑曲霉菌（Aspergillus niger）。

3 結論

釀造用曲中含有多種有益微生物，方春玉等[13]從瀘型大曲分離出黑曲霉菌進行了酸性蛋白酶產酶研究，秦臻等[14]從保寧麩醋醋曲中定向篩選出生淀粉分解酶梨頭霉進行了產酶研究，李江華等[15]從酒曲中分離篩選出一株真菌α-淀粉酶產生菌米曲霉進行了研究。

利用纖維二糖固體平板分離培養(yǎng)基、纖維素-剛果紅平板分離固體培養(yǎng)基初篩，液體發(fā)酵產酶培養(yǎng)基搖瓶復篩相結合，從釀造磚曲中分離篩選出一株能高效生產β-葡萄糖苷酶的菌株R16。通過菌株菌落的形態(tài)特征、顯微形態(tài)，及菌株18S rDNA的序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育分子生物學分析，鑒定為黑曲霉屬（Aspergillus）黑曲霉菌（Aspergillus niger）。該菌株遺傳穩(wěn)定性好，其產生的β-葡萄糖苷酶安全性好，具有較高的研究應用價值。

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