吳全 李文東 趙景明 柏楠 郭晏同 崔愛民 張軍

（北京積水潭醫(yī)院普通外科 北京 100035）

ERK1／2（Extracellular signal-related Kinase1／2）是Ras／Raf／MEK／ERK信號(hào)通路中重要分子，被EGFR激活發(fā)生磷酸化，穿越核膜進(jìn)入胞核，抑制NF-κB、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，參與抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行［1］。絲氨酸／蘇氨酸激酶（Serine／threonine Kinase，AKT）在轉(zhuǎn)導(dǎo)PI3K 始動(dòng)的生物信號(hào)過程中發(fā)生磷酸化并向下調(diào)控其目標(biāo)因子，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤血管的生成，PI3K／AKT通路活化也受EGFR、Ras分子調(diào)節(jié)［2］。不少研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）中ERK1／2、AKT信號(hào)通道異?；罨嵌吡姿峄≒hosphorylation，p）表達(dá)模式與CRC臨床病理特征的關(guān)系各家報(bào)道的結(jié)果并不完全一致［3～6］，并且它們共同預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值尚有待探討，本研究針對(duì)上述問題運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)CRC手術(shù)標(biāo)本中pERK1／2、pAKT表達(dá)并進(jìn)行相關(guān)的生存分析，以期豐富它們表達(dá)意義的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 2005年1月至2009年12月接受手術(shù)治療的84例CRC患者，手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)石蠟切片證實(shí)為腺癌。本組病例男45例，女39例，年齡66.9±11.1歲，結(jié)腸癌71例，直腸癌13例，臨床Ⅰ～Ⅳ期（AJCC／UICC分期）病例分別為22、26、24和12例，另收集13例因腹外傷行結(jié)腸或直腸切除病例，作為對(duì)照組，其中男8例，女5例，年齡40.0±13.3歲。CRC病例既往無惡性腫瘤病史，術(shù)前未接受放化療，對(duì)照病例不合并惡性腫瘤。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組化切片制備 調(diào)取上述病例存檔石蠟塊，采樣部位為CRC癌灶和癌旁5cm以遠(yuǎn)的正常腸黏膜以及對(duì)照病例腸黏膜，4μm厚度連續(xù)切片，放置于防脫玻片上。

1.2.2 免疫染色 采用MaxVisionTM即用型快速免疫組化一步法。切片常規(guī)脫蠟、水化，檸檬酸鹽高溫高壓抗原修復(fù)，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清封閉，滴加相應(yīng)一抗：pERK1／2（Thr185＋Tyr187）鼠單抗（1∶100，ab50011，Abcam Inc，USA）和pAKT（Ser473）兔單抗（1∶150，CST3787，Cell Signaling，USA），4℃過夜；滴加MaxVisionTM2（KIT-5930，福建邁新）工作液于37℃下孵育30min，DAB顯色3min，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹脂封片。

1.2.3 結(jié)果判斷 以黏膜上皮細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽性比例數(shù)進(jìn)行綜合評(píng)定待測(cè)因子的表達(dá)等級(jí)。高倍視野下（400×）觀察300個(gè)細(xì)胞，胞漿或胞核呈淡紅棕色評(píng)1分，中度著色2分，深染3分，計(jì)算各分值細(xì)胞比例，代入綜合評(píng)分IHCs＝1分細(xì)胞%×1＋2分細(xì)胞%×2＋3分細(xì)胞%×3，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野取平均值，IHCs均值＜0.1判定為不表達(dá)（-），≤0.1—1為弱陽性（＋），＜1.0-1.5為中等陽性（＋＋），＞1.5為強(qiáng)陽性（＋＋＋）。

1.3 隨訪 采用書信與電話相結(jié)合的方式，截止日期：2012年11月30日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料采用±sD表示，兩組間均數(shù)比較采用t或t′檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素ANOVA分析，兩兩比較采用Bonferroni法；計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析；生存分析采用壽命表法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α＝0.05，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pERK1／2和pAKT表達(dá)模式與CRC臨床病理特征的關(guān)系 在癌組織和正常腸黏膜中均可見pERK1／2和pAKT表達(dá)，陽性顆粒分布于胞核及胞漿內(nèi)，參見圖1。在CRC病例中，癌灶pERK1／2和pAKT表達(dá)率分別為65.5%和58.3%，癌旁為45.2%和44.0%，癌灶pERK1／2、pAKT表達(dá)率與癌旁比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。對(duì)照病例腸黏膜pERK1／2、pAKT表達(dá)率分別為30.8%、15.4%，顯著低于癌灶，P＜0.05。pERK1／2單陽性表達(dá)病例的腫瘤直徑（6.45±2.8cm）顯著大于pAKT單陽性病例（4.00±1.9cm），P＝0.012；pERK1／2、pAKT雙陽性病例LN發(fā)生轉(zhuǎn)移的陽性率為52.9%，顯著高于雙陰性病例（7.1%），P＝0.003，見表1。

癌灶pERK1／2表達(dá)與pAKT（r＝0.247）、腫瘤T分期／浸潤(rùn)深度（r＝0.269）、N 分期（r＝0.253）、腫瘤分化度（r＝0.257）呈顯著正相關(guān)；癌灶pAKT表達(dá)與腫瘤N分期（r＝0.292）呈顯著正相關(guān)，P＜0.05；癌灶pERK1／2或pAKT表達(dá)與性別、年齡、腸梗阻、CEA和 Hb水平、腫瘤部位、大小、組織學(xué)類型、臨床分期不相關(guān)，P＞0.05。

2.2 隨訪結(jié)果 術(shù)后隨訪率81.0%（68／84例），隨訪期內(nèi)死亡23例（死亡原因與CRC相關(guān)），無局部復(fù)發(fā)，發(fā)生遠(yuǎn)隔部位轉(zhuǎn)移14例。1、3、5年總體生存率分別為87.2%、42.3%、18.6%，I～I(xiàn)V期5年生存率分別為50.7%、35.9%、19.1%、0%，中位生存時(shí)間（月）分別為65.2、41.9、39.4、36.9，I期和III、IV的5年生存率、中位生存時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。

圖1 對(duì)照病例腸黏膜和CRC癌灶pERK1／2和pAKT的表達(dá)（400×）

表1 84例CRC癌灶pERK1／2、pAKT表達(dá)模式與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 pERK1／2和pAKT與預(yù)后 癌灶pERK1／2（＋）病例的5年生存率為31.7%，中位生存時(shí)間46.2月，pAKT（＋）5年生存率37.1%，中位生存時(shí)間48.5月，pERK1／2（＋）pAkt（＋）5 年生存率28.6%，中位生存時(shí)間39.8月，pERK1／2（-）pAKT（-）5年生存率43.1%，中位生存時(shí)間56.8月，任二者之間5年生存率、中位生存時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。

3 討 論

在既往的研究中，pERK1／2、pAKT抗凋亡作用研究較為透徹：磷酸化Bcl-2的Ser-70位點(diǎn)激活Bcl-2的完整抗凋亡功能［7］，上調(diào)DNA結(jié)合蛋白AP-1的活性，促進(jìn)凋亡抑制因子Bcl-xl表達(dá)［8、9］，但是它們與CRC臨床病理的關(guān)系在目前的文獻(xiàn)報(bào)道中不完全一致。Amsterdam 等人［3］發(fā)現(xiàn)pERK1／2表達(dá)陽性的結(jié)腸癌Kras表達(dá)增強(qiáng)，p53表達(dá)減弱，提示pERK1／2表達(dá)與腫瘤發(fā)生相關(guān)，相對(duì)低分化腫瘤，高分化的腫瘤p53表達(dá)水平增強(qiáng)而pERK1／2表達(dá)減弱，相類似的，CRC癌灶pAKT表達(dá)與腫瘤的分化、T和N分期呈正相關(guān)，在LN陰性的乳腺癌病人中，pAKT表達(dá)陽性與Her2／neu過表達(dá)強(qiáng)烈相關(guān)，患者生存期更短［4、6、10］，但是 Baba等［5］分析717例CRC卻發(fā)現(xiàn)pAKT表達(dá)陽性與高等級(jí)腫瘤（Ⅲ～Ⅳ級(jí)）呈顯著負(fù)相關(guān)，陽性表達(dá)病例有更長(zhǎng)的生存期，他們認(rèn)為pAKT表達(dá)是預(yù)后良好的標(biāo)志。

本研究發(fā)現(xiàn)，癌灶pERK1／2和pAKT陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，癌灶陽性表達(dá)率與癌旁比較有增高的趨勢(shì)，進(jìn)一步相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，癌灶pERK1／2表達(dá)與pAKT正相關(guān)，并且它們與腫瘤的大小、浸潤(rùn)深度、分化程度、T和N分期顯著正相關(guān)，尤其是二者共表達(dá)顯著與N分期相關(guān)，這些結(jié)果共同提示pERK1／2、pAKT信號(hào)通道異常激活是CRC的一個(gè)特征變化，我們更傾向于認(rèn)為二者表達(dá)水平上調(diào)可能在腫瘤進(jìn)展、侵襲性增強(qiáng)方面發(fā)揮了積極的作用。造成pAKT表達(dá)意義在不同研究結(jié)果中出現(xiàn)差異的原因，我們推測(cè)可能與方法學(xué)（pAKT一抗識(shí)別的磷酸化位點(diǎn)、陽性判定標(biāo)準(zhǔn)等）以及入選病例不同有關(guān)，Baba等人的研究中很多病例有PI3kCA基因突變［5］。

在生存分析中，我們發(fā)現(xiàn)pERK1／2、pAKT雙陽性表達(dá)病例、單陽性病例、雙陰性病例的5年生存率和中位生存時(shí)間在趨勢(shì)上依次上升，雖然最終統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異，這可能與病例數(shù)相對(duì)較少有關(guān)，但是結(jié)果在一定程度上有助于佐證了pERK1／2、pAKT表達(dá)與腫瘤惡性程度、侵襲性有關(guān)，二者共表達(dá)提示腫瘤有更強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能。由于CRC發(fā)生、進(jìn)展是一個(gè)后生漸成的事件，與多基因表達(dá)或缺失效應(yīng)的累積相關(guān)，從我們的研究結(jié)果看，尚不能體現(xiàn)pERK1／2、pAKT作為獨(dú)立因子用于預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值，因此，二者可能更多時(shí)候僅在信號(hào)傳導(dǎo)通路中扮演居中調(diào)控的角色?？傊?，pERK1／2、pAKT在CRC中異常表達(dá)提示腫瘤高侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，阻斷或下調(diào)其表達(dá)可能使腫瘤降期，它們有希望成為腫瘤治療的作用位點(diǎn)。

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