董文賓, 趙瑩瑩

(陜西科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，它在食品中的可應(yīng)用性不僅依賴于它的營(yíng)養(yǎng)性，還依賴于它的功能性.凝膠性是大豆蛋白最重要的功能特性之一，許多大豆食品的加工就是利用大豆蛋白的凝膠化來(lái)制作的.大豆蛋白的適度變性是形成凝膠的基礎(chǔ)[1]，已有研究表明通過(guò)對(duì)大豆蛋白進(jìn)行改性處理，可以改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善大豆蛋白的溶解性.

在許多大豆制品的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中，主要是通過(guò)對(duì)大豆蛋白進(jìn)行熱處理來(lái)達(dá)到大豆蛋白變性的目的.有研究表明，大豆蛋白的改性方法可以分為物理改性、化學(xué)改性和酶法改性[2].其中，酶法改性是通過(guò)酶降解蛋白質(zhì)來(lái)改變蛋白質(zhì)的功能特性，且酶法改性具有物理、化學(xué)改性等無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)：如營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不會(huì)降低、反應(yīng)條件溫和、作用具有獨(dú)特專一性、反應(yīng)進(jìn)程容易控制、無(wú)不良副反應(yīng)和總體安全等[3].據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道，一些蛋白酶還具有使大豆?jié){料凝固的能力，因此本文采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)大豆?jié){料進(jìn)行酶解改性，研究其對(duì)大豆蛋白性質(zhì)的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：大豆，市售；木瓜蛋白酶，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；AS1.398中性蛋白酶，西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；血紅素標(biāo)準(zhǔn)品，Alfa Aesar公司，純度99%；葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL，Glucono-Delta-Lactone葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯).

主要儀器：PHS-3C精密pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器，常州國(guó)華電器有限公司；TDL-40B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；KDN-04C型數(shù)顯消化爐、KDN-04C型凱氏定氮儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System公司；SD-Basic噴霧干燥儀，英國(guó)Labplant公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆?jié){料的制備

制備過(guò)程為：大豆原料→磨漿→煮漿→調(diào)配均質(zhì)[5]→調(diào)pH→酶解→不同水解度的酶解液→噴霧干燥制粉→測(cè)NSI值.

將浸泡過(guò)的大豆以1∶10的料水比進(jìn)行磨漿[6,7]，用尼龍布過(guò)濾后得大豆?jié){料.將制得的大豆?jié){料在95 ℃水浴條件下熱處理10 min，并調(diào)配至所需的pH值.加入一定量的蛋白酶進(jìn)行酶解，并采用pH-stat法[8]控制體系的pH值，根據(jù)滴加的堿量控制所需制備的水解度.

將制得的不同水解度的水解樣品加入一定量的GDL制成凝膠之后，測(cè)定其凝膠強(qiáng)度和凝膠失水率；將不同水解度的水解樣品進(jìn)行噴霧干燥制粉，噴霧干燥條件[9,10]設(shè)定為：進(jìn)風(fēng)溫度150 ℃，出風(fēng)溫度80 ℃，然后測(cè)定其NSI值.

1.2.2 蛋白酶酶活力的測(cè)定

采用福林顯色法測(cè)定蛋白酶活力.福林-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng).蛋白質(zhì)中具有含有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)，因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也易被酚類化合物還原呈藍(lán)色反應(yīng).福林顯色法就是利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸的呈色反應(yīng)，來(lái)間接測(cè)定蛋白酶的活力.

一個(gè)酶活力單位定義為1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)，在40 ℃(酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5)的條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量.

蛋白酶的活力=A×K×4/10×nμ/g

式中，A：樣品平行試驗(yàn)的平均OD值;K：吸光常數(shù);4：反應(yīng)試劑的總體積;10：酶解反應(yīng)時(shí)間;n：酶液稀釋總倍數(shù).

1.2.3 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

質(zhì)構(gòu)儀測(cè)豆腐腦凝膠強(qiáng)度.探頭型號(hào)：P/0.5；測(cè)前速度：1 mm/sec；測(cè)試速度：2 mm/sec；側(cè)后速度：1 mm/sec；探頭下降深度：8 mm/sec.使凝膠破碎的最大力為凝膠強(qiáng)度，單位是g.每個(gè)樣品測(cè)3個(gè)平行.

1.2.4 凝膠失水率的測(cè)定

將測(cè)過(guò)凝膠強(qiáng)度的豆腐腦取一定量放入離心管中，放入4 000 r/min的離心機(jī)中離心5 min，然后傾出離心管內(nèi)游離水分，并用濾紙小心將管內(nèi)吸附于離心管壁處的可見(jiàn)水分吸出，稱重.

失水率W(%)=(W1-W2)/W1×100

式中，W1：離心前豆腐腦的重量(g)；W2：離心后豆腐腦的重量(g).

1.2.5 大豆蛋白溶解性NSI的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.50 g豆腐腦粉，加30 mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌1 h，然后移至50 mL容量瓶中定容.靜置30 min后，取上清液于離心管中，放入1 500 r/min的離心機(jī)中離心10 min，將離心所得上清液進(jìn)行消化定氮.以氮溶指數(shù)NSI表示大豆蛋白的溶解性.

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白水解酶的相關(guān)性質(zhì)

研究表明，動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶以及微生物蛋白酶都可以水解大豆蛋白以提高其功能特性[11].但考慮到動(dòng)物蛋白酶價(jià)格昂貴、副反應(yīng)多，工業(yè)生產(chǎn)大多選用植物蛋白酶和微生物蛋白酶.所以，本文采用木瓜蛋白酶和AS1.398中性蛋白酶這兩種酶源進(jìn)行研究，其相關(guān)性質(zhì)見(jiàn)表1.

表1 兩種蛋白水解酶的相關(guān)性質(zhì)

由圖1可得酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.009 3x+0.004 8，R2=0.998 7.從直線的斜率計(jì)算K值：K=107.01，由此可得兩種蛋白酶的酶活.在實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得的兩種蛋白酶的酶活見(jiàn)表2.

圖1 蛋白酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 兩種蛋白酶的酶活

2.2 不同水解度對(duì)凝膠強(qiáng)度影響

由圖2、圖3可知，不同水解度樣品的凝膠強(qiáng)度比未經(jīng)水解樣品的凝膠強(qiáng)度低很多.由此可見(jiàn)，蛋白酶的水解作用對(duì)大豆蛋白的凝膠性能是不利的.這可能是因?yàn)殡S著酶解作用的進(jìn)行，漿料中的大分子蛋白質(zhì)的肽鏈逐漸變短，而較短的肽鏈轉(zhuǎn)動(dòng)自由度比較大，空間位阻也比較小，使得肽鏈之間相互纏繞形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力就比較弱，因此導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度也降低.由圖可知，在蛋白酶的水解樣品中，凝膠強(qiáng)度隨水解度的增大變化幅度不大.

圖2 木瓜蛋白酶對(duì)凝膠性能的影響

圖3 中性蛋白酶對(duì)凝膠性能的影響

2.3 不同水解度對(duì)凝膠失水率的影響

由圖4可知，在木瓜蛋白酶的水解初期，隨著水解度的增大，大豆蛋白的凝膠失水率呈逐漸降低的趨勢(shì)，但波動(dòng)不大.當(dāng)水解度DH>4%時(shí)，凝膠失水率增大幅度加??；由圖5可知，在中性蛋白酶的水解初期，隨著水解度的增加，凝膠失水率逐漸增大，當(dāng)水解度DH>6%時(shí)，凝膠失水率增大幅度加劇.

圖4 木瓜蛋白酶對(duì)凝膠失水率的影響

圖5 中性蛋白酶對(duì)凝膠失水率的影響

凝膠失水率在水解樣品達(dá)到一定水解度之后急劇增大的原因可能是因?yàn)殡S著水解作用的增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子變性程度逐漸增強(qiáng)，產(chǎn)生的較短肽鏈形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力比較差，使得凝膠的保水性變?nèi)?

2.4 不同水解度對(duì)溶解性的影響

由圖6、圖7可知，蛋白酶水解樣品的大豆蛋白溶解性比未水解樣大很多.兩種蛋白酶的水解樣品隨著水解度的增大，大豆蛋白的溶解性變化都比較復(fù)雜，但整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì).

圖6 木瓜蛋白酶對(duì)大豆蛋白溶解性的影響

圖7 中性蛋白酶對(duì)大豆蛋白溶解性的影響

大豆蛋白溶解性隨著水解度的增大而增大的原因，可能是因?yàn)榈鞍酌傅乃馐勾蠖節(jié){料中的大分子蛋白質(zhì)水解成了小分子肽類和氨基酸，而小分子的肽類和氨基酸易溶于水.過(guò)度水解雖然在很大程度上縮短了肽鏈長(zhǎng)度，增加了大豆蛋白的溶解性，但同時(shí)也使埋藏在長(zhǎng)肽鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水性氨基酸大量暴露而導(dǎo)致苦味的產(chǎn)生，這對(duì)于食品飲料而言是不能接受的.因此，要想得到無(wú)苦味、凝膠性能較好，且溶解性也較好的產(chǎn)品，只能對(duì)大豆蛋白質(zhì)進(jìn)行限制性的輕度水解[12].

3 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，采用蛋白酶水解熱處理后的大豆?jié){料，進(jìn)行限制性酶解后得到的大豆蛋白的NSI值都得到了很大地提高，相對(duì)未經(jīng)水解的樣品提高了40%左右，顯著提高了大豆蛋白的溶解性.

但考慮到水解度對(duì)凝膠保水性的影響，木瓜蛋白酶選擇的最佳水解度為DH=2%，此時(shí)的NSI=81.22%，相對(duì)未經(jīng)水解的樣品提高了45.63%；中性蛋白酶選擇的最佳水解度為DH=2%，此時(shí)的NSI=68.27%，相對(duì)未經(jīng)水解的樣品提高了32.68%.

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