劉洪斌 侯東軍 楊紅菊 田曉玲 馬 帥 姜艷彬 王 海 于 雷*

（1.農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京 100125；

2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，沈陽 110016）

飼料中芽孢桿菌的檢測及存在問題的分析

劉洪斌1侯東軍1楊紅菊1田曉玲2馬 帥2姜艷彬1王 海1于 雷1*

（1.農(nóng)業(yè)部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京 100125；

2.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，沈陽 110016）

本研究通過對(duì)飼料樣品中的芽孢桿菌檢測，發(fā)現(xiàn)目前國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26428-2010《飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》中存在的一些問題：即通過國標(biāo)方法鑒定，該飼料中的添加劑為枯草芽孢桿菌，而通過常規(guī)菌種鑒定的16S rDNA序列測定和生理生化指標(biāo)分析，無法判定該結(jié)果。經(jīng)過分子生物學(xué)方法，鑒定該細(xì)菌為解淀粉芽孢桿菌。作為暫時(shí)未經(jīng)許可應(yīng)用于飼料添加劑的解淀粉芽孢桿菌，以目前的國標(biāo)方法還無法檢出，本研究為探索其檢測方法提供了一些建議。

飼料 微生物添加劑 芽孢桿菌 檢測方法

微生物飼料添加劑又稱益生素，是當(dāng)攝入量足夠時(shí)能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益作用的活性微生物（FAO，WHO，2001），微生物飼料添加劑具有維護(hù)動(dòng)物腸道健康、緩解不良應(yīng)激、改善畜舍環(huán)境、調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪代謝和改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的功能。還有研究者認(rèn)為，微生物飼料添加劑具有替代抗生素功能的作用（徐鵬等，2012）。

在國外，早在20世紀(jì)60年代開始使用益生菌作為人類保健食品和飼料微生物添加劑，20世紀(jì)70年代美國、歐洲就有飼料微生物添加劑上市（何月英等，2005）。1989年美國食品藥物管理局（FDA）和美國飼料公定協(xié)會(huì)（AAFCO）公布了44種“可直接飼喂且通常認(rèn)為是安全的微生物” 作為微生態(tài)制劑的出發(fā)菌株。1999年6月，我國農(nóng)業(yè)部第105號(hào)文件發(fā)布的《允許使用的飼料添加劑品種目錄》，共計(jì)12種微生物，其中芽孢桿菌屬包括枯草芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌；2003年農(nóng)業(yè)部第318號(hào)公告中規(guī)定了14種允許使用的微生物，地衣芽孢桿菌列入，但納豆芽孢桿菌未列入；2006年農(nóng)業(yè)部658號(hào)公告規(guī)定了16種允許使用的微生物，芽孢桿菌屬包括枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌；2008年12月我國農(nóng)業(yè)部1126號(hào)公告規(guī)定了16種允許使用的微生物，芽孢桿菌屬依舊僅有枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。

本研究通過對(duì)飼料樣品芽孢桿菌的檢測，發(fā)現(xiàn)目前的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26428- 2010《飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》中存在的一些問題，其不能有效的區(qū)分枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌，并提出了相應(yīng)的改進(jìn)方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)菌染色體DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Mastermix、DL2000核酸分子量Marker、100bp DNA Ladder購自天根生化科技（北京）有限公司；營養(yǎng)瓊脂、LB培養(yǎng)基等購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；DNA測序由北京華大基因研究中心完成；API 50CHB細(xì)菌鑒定系統(tǒng)購自生物梅里埃中國有限公司。有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 飼料樣品芽孢桿菌的檢測

主要依照GB/T 26428-2010《飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》進(jìn)行飼料中枯草芽孢桿菌的檢測，并進(jìn)行了少量的修改：菌落計(jì)數(shù)中，將芽孢桿菌的培養(yǎng)時(shí)間由48±2 hr縮短至18-20hr。

1.3 16S rDNA的克隆及序列測定

挑取3株通過GB/T 26428-2010方法分離得到的平皿單菌落，在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，各取5mL 菌液提取染色體DNA，電泳定量后，用引物AD007 和AD008 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系50μL：上游引物2μL（10mM），下游引物2μL（10mM），模版1μL（約50ng），2×Taq PCR Mastermix 25μL，超純水20μL。擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72℃，90 s；重復(fù)2～4 步驟，進(jìn)行29 個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，以引物AD007 和AD008 進(jìn)行測序，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)。

1.4 生理生化測定

將測序的3株細(xì)菌進(jìn)行生理生化測試，分別取平皿單菌落，懸浮于10 mL 的API 50CHB培養(yǎng)基中，加入API 50CHB測試板中，37℃培養(yǎng)48 h后觀察，與判讀表比對(duì)獲取生理生化信息。

1.5 枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)兩篇文獻(xiàn)（劉勇等，2010；曹鳳明等，2008）報(bào)道的方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定并進(jìn)行了小量修改，引物序列見表1。擴(kuò)增體系50μL：上游引物2μL（10mM），下游引物2 μL（10 mM），模版1 μL（約50 ng），2×Taq PCR Mastermix 25μL，超純水20μL。擴(kuò)增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，60 s；重復(fù)2-4 步驟，進(jìn)行29 個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，以相應(yīng)引物進(jìn)行測序，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)。

表1 試驗(yàn)選擇的引物對(duì)

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料樣品的芽孢桿菌檢測（國標(biāo)方法）

將飼料樣品梯度稀釋后，涂布于營養(yǎng)瓊脂平板中，37℃培養(yǎng)18hr后計(jì)數(shù)。在稀釋倍數(shù)為106的3個(gè)平板中，其菌落數(shù)分別為39、41和49個(gè)。

取5個(gè)菌落進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，5株菌表面粗糙、不透明，灰白色；革蘭氏染色陽性，鏡檢細(xì)胞為桿狀，有芽孢，符合枯草芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)要求。

按照GB/T 26428-2010進(jìn)行了5株菌的7%氯化鈉生長、V-P實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、丙酸鹽利用實(shí)驗(yàn)和D-甘露醇產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)。5株菌的生理生化指標(biāo)相同，其結(jié)果如表2所示。

表2 飼料樣品中芽孢桿菌生理生化指標(biāo)（國標(biāo)方法）

根據(jù)菌落形態(tài)、染色鏡檢及生理生化指標(biāo)，通過GB/T 26428-2010判斷該飼料樣品中的含有芽孢桿菌，其含量為為4.3×107cfu/g。

2.2 16S rDNA序列測定

挑取3株通過GB/T 26428-2010分離得到的平皿單菌落，以引物AD007、AD008進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，在1%的瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，其擴(kuò)增產(chǎn)物均為1600bp條帶（圖略）。

取擴(kuò)增產(chǎn)物，以AD007、AD008為測序引物，進(jìn)行核酸序列測定。測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，3個(gè)菌落PCR獲得的序列相同，其16S rDNA的序列與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌中的多株菌同源性達(dá)到98%（如圖1所示），可以判斷其為芽孢桿菌屬。

圖1 芽孢桿菌的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果

2.3 生理生化測定

根據(jù)16S rDNA測序結(jié)果，選用適合于芽孢桿菌的API 50 CHB試劑盒進(jìn)行各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的測定，在37℃溫箱中培養(yǎng)48 h后，3株菌的生理生化指標(biāo)相同，與判讀表比對(duì)獲得生理生化指標(biāo)如表3所示。

經(jīng)軟件分析，該細(xì)菌為枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌，可信度為99%，但無法確定該細(xì)菌為枯草芽孢桿菌。

2.4 枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌的分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)16S rDNA序列測定及API 50CHB的生理生化指標(biāo)，為了進(jìn)一步判斷該細(xì)菌，參考了文獻(xiàn)中報(bào)道的兩種分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

通過解淀粉芽孢桿菌的2對(duì)引物對(duì)擴(kuò)增，在2%瓊脂糖凝膠電泳中分別獲得了736 bp和1 275 bp的條帶，與文獻(xiàn)中報(bào)道的結(jié)果相同，而通過枯草芽孢桿菌的2對(duì)引物對(duì)均為獲得任何擴(kuò)增條帶（圖略）。

將擴(kuò)增出的條帶測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果表明，兩組測序結(jié)果均與解淀粉芽孢桿菌有很高的同源性，而與枯草芽孢桿菌的同源性很低，如圖2和圖3所示。

表3 芽孢桿菌的API 50CHB生理生化指標(biāo)

圖2 芽孢桿菌特異性基因序列比對(duì)結(jié)果1

圖3 芽孢桿菌特異性基因序列比對(duì)結(jié)果2

3 討論

3.1 現(xiàn)存國標(biāo)存在的問題

目前應(yīng)用于飼料中枯草芽孢桿菌檢測的最新國標(biāo)為GB/T 26428- 2010《飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》，其在檢測時(shí)存在以下兩點(diǎn)問題：

（1）芽孢桿菌生長迅速，最佳培養(yǎng)條件下每20 min即繁殖1代。在使用國標(biāo)進(jìn)行檢測時(shí)，37℃培養(yǎng)48 h，菌落直徑可以達(dá)到1 cm以上，按照標(biāo)準(zhǔn)中要求每個(gè)平板30～300個(gè)菌落，普通的90 cm平皿幾乎鋪滿，很難進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果改為培養(yǎng)時(shí)間為18 h，則菌落較小，適于計(jì)數(shù)操作。

（2）在目前的國標(biāo)中，暫無法對(duì)枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行區(qū)分，而后者暫時(shí)沒有列在允許使用的飼料添加劑名單中。

3.2 枯草芽孢桿菌的鑒定

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）、萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）是在進(jìn)化上親緣關(guān)系較為接近的芽孢桿菌（Robert MS，1994），這些菌從形態(tài)學(xué)到生理生化特征存在很多相同之處，在鑒定或檢測中很難準(zhǔn)確區(qū)分（東秀珠等，2001）。

芽孢桿菌最常用的鑒別方法為生理生化法，通過梅里埃的API 50CHB或Biolog的GEN III鑒定板均可以快速、準(zhǔn)確的獲得一系列指標(biāo)進(jìn)行鑒定，但其在有些芽孢桿菌區(qū)分鑒定中還存在一些局限性，例如枯草芽孢桿菌/解淀粉芽孢桿菌的鑒定、蘇云金芽孢桿菌/蠟樣芽孢桿菌/蕈狀芽孢桿菌的鑒定。對(duì)于這些無法通過生理生化指標(biāo)鑒定的菌種，通過分子生物學(xué)進(jìn)行輔助鑒定，將能夠更準(zhǔn)確的進(jìn)行芽孢桿菌的鑒定。

3.3 工業(yè)微生物菌種鑒定存在的問題

除了芽孢桿菌外，還有很多用于工業(yè)生產(chǎn)、畜牧養(yǎng)殖、環(huán)境保護(hù)等方面的細(xì)菌，由于這些菌種經(jīng)過了選育，在某一方面具有特殊的形狀，造成了其可能在生理生化指標(biāo)方面與天然菌株存在一定的差異。

本研究中的解淀粉芽孢桿菌，可以在10%的NaCl培養(yǎng)基中生長；在生產(chǎn)廠家給出的鑒定報(bào)告中，對(duì)照菌株解淀粉芽孢桿菌KCCM不能再10%的NaCl培養(yǎng)基中生長，因此判定本研究中的細(xì)菌為枯草芽孢桿菌，結(jié)論有些武斷。

通過全基因組測序，進(jìn)行序列比對(duì)是最準(zhǔn)確的菌種鑒定方法，但對(duì)成本和時(shí)間的要求都很高。但對(duì)于使用價(jià)值較高，已經(jīng)有相同模式菌全基因組序列的工業(yè)生產(chǎn)菌來說，還是事半功倍的，其在避免生理生化指標(biāo)產(chǎn)生誤區(qū)時(shí)，也排除了普通分子生物學(xué)檢測中菌體攜帶質(zhì)粒造成的誤判。

[1] 曹鳳明，沈德龍，李俊，等.應(yīng)用多重PCR鑒定微生物肥料常用芽孢桿菌[J].微生物學(xué)學(xué)報(bào)，2008，48（5）：651-656.

[2] 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

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