程 田 舒 麗 林瑞慶

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；

2.四川省富順縣永年鎮(zhèn)獸醫(yī)站，富順 643200）

豬食道口線(xiàn)蟲(chóng)核糖體18S部分序列的PCR擴(kuò)增及分析

程 田1舒 麗2林瑞慶1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；

2.四川省富順縣永年鎮(zhèn)獸醫(yī)站，富順 643200）

以保守引物擴(kuò)增豬體的食道口線(xiàn)蟲(chóng)rDNA 18S的部分序列并進(jìn)行測(cè)序和分析。實(shí)驗(yàn)獲得18S部分有效序列大小為894 bp，序列非常保守，兩個(gè)蟲(chóng)種之間不存在差異，僅發(fā)現(xiàn)四棘食道口線(xiàn)蟲(chóng)樣品存在一個(gè)變異位點(diǎn)，與其他線(xiàn)蟲(chóng)相應(yīng)序列比較有不同程度的差異。本研究首次報(bào)道了豬食道口線(xiàn)蟲(chóng)的18S序列，為食道口線(xiàn)蟲(chóng)的分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

食道口線(xiàn)蟲(chóng) rDNA PCR 序列分析

豬食道口線(xiàn)蟲(chóng)屬于圓形目（Strongyloidea）食道口屬（Oesophagostomum）。有齒食道口線(xiàn)蟲(chóng)（Oesophagostomum dentatum）和四棘食道口線(xiàn)蟲(chóng)（Oesophagostomum quadrispinulatum）是感染豬的兩個(gè)常見(jiàn)種，因常寄生于豬的腸壁形成結(jié)節(jié)狀的病變，故有“結(jié)節(jié)蟲(chóng)”之稱(chēng)[1]。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，尋找豬食道口線(xiàn)蟲(chóng)與其他寄生蟲(chóng)之間及屬內(nèi)不同種之間的分子分類(lèi)的標(biāo)記，在豬食道口線(xiàn)蟲(chóng)病的流行病學(xué)和疾病監(jiān)控與防治方面都具體非常重要的意義。

大部分生物細(xì)胞核糖體DNA（rDNA）從5′到3′包括非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA、外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)DNA、18S rRNA基因、兩側(cè)具有內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）DNA的5.8SrDNA基因和28SrRNA基因的重復(fù)基因單位[2]。核糖體各部分序列均有應(yīng)用于寄生蟲(chóng)的分子分類(lèi)學(xué)和分子遺傳學(xué)研究中，但目前豬食道口線(xiàn)蟲(chóng)18S序列的分析未見(jiàn)報(bào)道。有鑒于此，本研究以我國(guó)不同地區(qū)豬的食道口線(xiàn)蟲(chóng)作為研究對(duì)象，PCR擴(kuò)增其18S rDNA基因部分序列，并進(jìn)行序列測(cè)定和分析，為食道口線(xiàn)蟲(chóng)的分子生物學(xué)的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蟲(chóng)體樣品

蟲(chóng)體樣品來(lái)自中國(guó)湖南懷化（樣品編號(hào)：OspHN1、OspHN2、OspHN3）、廣東陽(yáng)江（樣品編號(hào)：OspYJ1）、重慶渝北（樣品編號(hào)：OspYB1）、重慶永川（樣品編號(hào)：OspYC1），形態(tài)學(xué)初步鑒定為食道口線(xiàn)蟲(chóng)，后經(jīng)特異PCR分子鑒定定種[3]。

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒WizardTMDNA Clean-Up System、pGEM-T Easy載體試劑盒均為Promega產(chǎn)品；Ex Taq酶，DL-2000 DNA Marker均為T(mén)aKaRa產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒為上海生工產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞DH5α為獸醫(yī)寄生蟲(chóng)學(xué)研究室保存。

1.3 蟲(chóng)體DNA提取

從70%酒精保存液中取出單個(gè)蟲(chóng)體，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗2次后，再用純凈水反復(fù)沖洗2～3次，置于新的1.5 ml 的eppendorf管中，用滅菌微型剪刀將蟲(chóng)體組織剪碎，然后在純凈水中浸泡20 min。吸干水分，按照DNA 提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，將提取的DNA置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 18S rDNA序列片段PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank里豬蛔蟲(chóng)、秀麗線(xiàn)蟲(chóng)、犬惡心絲蟲(chóng)等的核糖體18S序列，設(shè)計(jì)一對(duì)保守引物（18SF：GAGGAGGTAGTGACGAAT和18SR：GGACATCTAAGGGCATC），引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為25 μl，PCR反應(yīng)條件為先94℃預(yù)變性5 min，后94℃變性30 sec，46.5℃退火30 sec，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。同時(shí)設(shè)不加DNA模板的陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，于紫外透射儀上觀(guān)察并記錄結(jié)果。

1.5 測(cè)序

將PCR產(chǎn)物送深圳華大基因公司測(cè)序，然后進(jìn)行序列比較和分析。

2 結(jié)果

2.1 18S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

特異PCR分子鑒定表明湖南懷化樣品OspHN1、OspHN2和廣東陽(yáng)江OspYJ1為有齒食道口線(xiàn)蟲(chóng)，湖南懷化樣品OspHN3、重慶渝北樣品OspYB1和重慶永川OspYC1為四棘食道口線(xiàn)蟲(chóng)。以18SF和18SR作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物于1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可見(jiàn)約1000 bp的條帶，詳見(jiàn)圖1，與預(yù)期目的片段大小一致。

圖1 食道口線(xiàn)蟲(chóng)18S rDNA片段的PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 測(cè)序和分析

測(cè)序獲得食道口線(xiàn)蟲(chóng)18S rDNA部分基因有效序列大小為894 bp，序列非常保守，兩個(gè)蟲(chóng)種之間不存在差異，僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)四棘食道口線(xiàn)蟲(chóng)樣品存在一個(gè)A/C變異位點(diǎn)。詳見(jiàn)下面順序。

AGACCATTCCTATGGAACGGTCATTTCAATGAGTTGATCATAAACCTTTTTTCGAGGATCAAGTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCACT AGTGTAAATCGTCATTGCTGCGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATCTGAGTCACATGC AGTGGTTCGCCTTTGGCGTTAATCGCTGTTGTGACTATTTGCTGGTTTTCTACTAAG GTTTCGGCCTTTGTAGTGGCTAGCGAGTTTACTTTGAATAAATTAGAGTGCTCAGAACAGGCGTTTGCCTGAATGCTCGATCATGGAATAATAAAAGAGGACTTCGGTTCTATTTATTGGTTCAGGAACTGAAATAATGGTTAAGAGGGACAATTCGGGGGCATTCGTATC CCTGCGCGAGAGGTGAAATTCGTGGACCGCAGGGGGACGCCCTAAAGCGAAAGCATT TGCCAAGAATGTCTTCATTAATCAAGAACGAAAGTCAGAGGTTCGAAGGCGATTAGA TACCGCCCTAGTTCTGACCGTAAACTATGCCATCTAGCGATCCGATGGGGTATTGTTGCCTTGTCGAGGAGCTTCCCGGAAACGAAAGTCTTTCGGTTCCTGGGGTAGTATGGT TGCAAAGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAATGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTCACCCGGCCCGGACACCGTAAGGATTGACAGATTGAAA/CGCTCTTTCTCGATTTGGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGT TGGTGGAGCGATTTGTCTGGTTTATTCCGATAACGAGCGAGACTCTAGCCTGCTAAA TAGTGGCTGGATTTTTACGTCCAGTCTACTTCTTAGAGGGATAAG

將本試驗(yàn)中所測(cè)得的豬食道口線(xiàn)蟲(chóng)的18S rDNA序列與GenBank中收錄的同為圓形目夏伯特科的綿羊夏伯特線(xiàn)蟲(chóng)、冠尾科有齒冠尾線(xiàn)蟲(chóng)、網(wǎng)尾科絲狀網(wǎng)尾線(xiàn)蟲(chóng)、蛔目的豬蛔蟲(chóng)、桿形目的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)、旋尾目的犬惡心絲蟲(chóng)的相應(yīng)序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 豬食道口線(xiàn)蟲(chóng)基因序列的相似性比較

3 討論

編碼核糖體RNA的基因是由一些高度重復(fù)序列組成的多基因家族。rRNA基因以串聯(lián)重復(fù)形式存在于染色體上。由于rRNA基因中包含了進(jìn)化速度不等的編碼區(qū)、非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)，可以選擇其中保守程度不同的片段作為分子標(biāo)記來(lái)鑒定生物體不同種、亞種和地理株，以及研究其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，因此基于寄生蟲(chóng)核糖體序列的遺傳變異多態(tài)性特征已建立了許多寄生蟲(chóng)分子診斷方法[4-7]。18S rDNA序列較長(zhǎng)，并存在一些多變區(qū)，比較適合作為科級(jí)水平以上的分類(lèi)依據(jù)。本研究首次報(bào)道了豬有齒食道口線(xiàn)蟲(chóng)和四棘食道口線(xiàn)蟲(chóng)的18S rDNA的部分序列，結(jié)果顯示序列非常保守，兩個(gè)蟲(chóng)種間不存在差異，與其他線(xiàn)蟲(chóng)相應(yīng)序列比較顯示科以?xún)?nèi)非常保守，同目不同科有一定的差異，不同目的則差異較為明顯，表明18S rDNA可用于較高分類(lèi)階元寄生蟲(chóng)的遺傳變異和進(jìn)化分析。

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