呂靜靜 於學(xué)禪 沈秋霞 竺亞斌

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，寧波 315211)

引言

現(xiàn)在每年都有成千上萬的患者因各種疾病，導(dǎo)致組織和器官損傷或功能喪失，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康，需要重建或移植。然而因?yàn)榈赖聜惱?、傳統(tǒng)思想以及自身再生能力薄弱、異體間存在免疫排斥等各種原因，在體外重建出緊缺的組織或器官已經(jīng)迫在眉睫。組織工程與再生醫(yī)學(xué)就是利用組織再生的各種方法和技術(shù)重建出結(jié)構(gòu)性和功能性的人工組織器官，以修復(fù)或更新受損、壞死組織器官的科學(xué)［1］。它為組織器官損傷或功能衰竭的患者們帶來了巨大的希望，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。成功構(gòu)建組織工程的三大要素是種子細(xì)胞、支架材料和三維構(gòu)建，其中最基本、最核心就是種子細(xì)胞的選擇。目前，種子細(xì)胞的來源很多，如自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞或異種細(xì)胞等。但是這些種子細(xì)胞有著自身難以克服的缺點(diǎn)，大大降低了其在組織工程中應(yīng)用的可行性，或者根本無法滿足人為構(gòu)建工程化組織器官的需要。如自體細(xì)胞來源數(shù)量有限，在短時(shí)間內(nèi)體外擴(kuò)增困難，并常伴有去分化現(xiàn)象;同種異體或異種細(xì)胞容易引起病原體感染、具有免疫排斥等問題［2］。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞在一定條件下可以分化成人體幾乎所有的細(xì)胞［3-4］;成體干細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞等同樣也具有分化成其他細(xì)胞或組織的潛能［5］。干細(xì)胞的這種定向分化潛能使其成為了比較理想的種子細(xì)胞。另外，干細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新及定向分化能力，在細(xì)胞來源、增殖、定向分化及重建器官的植入等方面均具有較明顯的優(yōu)勢，在組織工程及臨床應(yīng)用上有著重要的應(yīng)用價(jià)值，因此干細(xì)胞是一種較為理想的種子細(xì)胞。現(xiàn)在干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在組織工程中的研究已然成為當(dāng)前生命科學(xué)的焦點(diǎn)，為攻克困擾人們的各種疑難雜癥帶來了希望。干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞來源的干細(xì)胞，已經(jīng)用于組織工程構(gòu)建的干細(xì)胞種類有胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等。本文結(jié)合國內(nèi)外最新研究進(jìn)展綜述了胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞的基本情況和發(fā)展現(xiàn)狀，綜述了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞作為組織工程研究的種子細(xì)胞的應(yīng)用和最新進(jìn)展，同時(shí)總結(jié)了現(xiàn)在研究中存在的困難和問題，對于干細(xì)胞相關(guān)研究的深入開展和具體實(shí)施具有重要指導(dǎo)意義。

1 胚胎干細(xì)胞

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)是在胚胎發(fā)育早期-囊胚(受精后約5 ～7 d)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的細(xì)胞，能大量繁殖并保持未分化狀態(tài)，也可以分化成三個(gè)胚層中的任意一種細(xì)胞［4，6］，有著其他來源干細(xì)胞不可比擬的優(yōu)勢，也因此成為各種組織和器官修復(fù)中引人注目的種子細(xì)胞。1981 年，英國Evans、Kaufman 和美國Martin 建立了最早的小鼠胚胎干細(xì)胞系［7-8］。此后，一系列其他動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞系也相繼建立起來。體外分離獲取胚胎，培養(yǎng)“巢狀”生長的胚胎干細(xì)胞系已不再是困擾ESC 研究的難題，定向誘導(dǎo)分化為組織工程提供新的種子細(xì)胞則成為了新的研究熱點(diǎn)。

目前對ESC 向血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞甚至神經(jīng)細(xì)胞等的體外分化已取得了可喜的成果，初步建立了一些體外誘導(dǎo)分化的技術(shù)和體系，并發(fā)現(xiàn)了一些特異的誘導(dǎo)分化物質(zhì)。ESC 體外誘導(dǎo)分化為特定組織細(xì)胞常選用三種策略:EB(擬胚體)分化方式、與成熟細(xì)胞或成纖維飼養(yǎng)層共培養(yǎng)以及添加化學(xué)試劑等。2010 年，Nourse 采用 EB 方法，運(yùn)用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)促進(jìn)ESC 向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，而不受細(xì)胞密度的影響［9］。然而這一方法的分化效率較低，如內(nèi)皮細(xì)胞分化僅為1% ～3%［10］，向平滑肌細(xì)胞分化也只是10%［11］。此外，由EB 方法分化得到的血管細(xì)胞還摻雜許多其他類型的細(xì)胞。國內(nèi)研究者岳偉在此基礎(chǔ)上利用免疫磁珠(FACS)、流式細(xì)胞儀(MACS)等分選出Flk-1 陽性的血管前體細(xì)胞，然后在VEGF、血小板衍生生長因子(PDGF)的誘導(dǎo)培養(yǎng)下，得到了構(gòu)建成熟血管的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞［12］。最近一些可以提高血管細(xì)胞分化效率的改進(jìn)EB 法被陸續(xù)報(bào)道，如:在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加生長因子VEGF-A［9］或BMP4(骨形成蛋白)［13］，結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境作用［14］或者阻斷TGF - β 通路［15］等。此外，在培養(yǎng)板上包被膠原蛋白IV［16］、纖維黏連蛋白［17-18］也能不同程度地提高ESC 分化成血管細(xì)胞的產(chǎn)率和質(zhì)量。令人驚喜的是Kane 發(fā)明的一種無血清分化方式，使內(nèi)皮細(xì)胞的分化效率達(dá)到81. 59% ±2. 11%［19］，Blancas 證實(shí)纖維黏連蛋白比膠原蛋白IV 更有利于ESC 的分化［15］。

研究證實(shí)ESC 也可以誘導(dǎo)分化為包括心房肌、心室肌、竇房結(jié)樣細(xì)胞等多種心肌細(xì)胞。Gold 和Matsuura 等讓 ESC 在體外分別接受二甲亞砜(DMSO)、新霉素以及明膠的處理發(fā)現(xiàn)ESC 具有心肌細(xì)胞的典型特征:有節(jié)律的自發(fā)收縮，甚至有肌管的形成［20-21］。Mummery 等將ESC 與內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞(也叫VE-樣細(xì)胞)共培養(yǎng)也誘導(dǎo)出了心肌細(xì)胞［22］，這些充分證明了ESC 可以為心肌再生提供種子細(xì)胞。最近Sanford-Burnham 醫(yī)學(xué)研究所、人類生物大分子研究所和ChemRegen 公司的研究人員合成的ITD -1 分子十分有利于ESC 分化為心肌細(xì)胞，大大提高了ESC 誘導(dǎo)分化的效率［23］。

人ESC 在膠原蛋白Ⅳ和角膜緣成纖維細(xì)胞的作用下，可以成功誘導(dǎo)出類角膜緣上皮細(xì)胞并表達(dá)出角膜上皮細(xì)胞特異標(biāo)志物CK13 及CK12，部分表現(xiàn)出上皮細(xì)胞的功能［24］。視黃酸(RA)誘導(dǎo)ESC向多種神經(jīng)細(xì)胞如神經(jīng)元分化［25］;胎牛血清促進(jìn)ESC 向造血干細(xì)胞分化［26］;在BMP2 和BMP4 的作用下，ESC 也可以生成軟骨的主要細(xì)胞如軟骨形成細(xì)胞［27］。通過上述的研究成果進(jìn)一步明確了ESC可以作為組織工程理想的種子細(xì)胞，參與下一步的器官再生與組織修復(fù)。

毫無疑問，人們對ESC 的定向誘導(dǎo)分化有了長足的認(rèn)識，能夠創(chuàng)造出越來越多的具有寶貴價(jià)值的細(xì)胞應(yīng)用于臨床實(shí)踐。但是ESC 研究領(lǐng)域有許多我們現(xiàn)今無法解決的難題:體外培養(yǎng)要求嚴(yán)格，ESC向特定細(xì)胞分化的機(jī)制不明，體內(nèi)致瘤性高，臨床應(yīng)用面臨著法律、倫理和道德等問題，如果這些困難得以解決，ESC 將成為組織工程領(lǐng)域優(yōu)秀的“種子細(xì)胞庫”。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，因能分化為間質(zhì)組織而得名。與ESC 相比MSC 有著自己獨(dú)特的優(yōu)勢:(1)來源廣泛，遍布在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶血中;(2)能抑制免疫應(yīng)答，異體移植不會發(fā)生排斥反應(yīng)，移植成功率顯著增加;(3)具有造血支持、免疫調(diào)控和促干細(xì)胞植入的能力［28］;(4)連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。目前MSC 的分離方法主要有全骨髓直接貼壁培養(yǎng)法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法、免疫磁珠負(fù)篩選法等。大多數(shù)采用的是密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法或免疫磁珠負(fù)篩選法相結(jié)合的方法，獲得了純度較高的MSC［29］。

近年來的研究表明MSC 雖來源于中胚層，卻可以分化出多種內(nèi)胚層和外胚層組織細(xì)胞，如食管、骨、軟骨、脂肪、心肌、血管內(nèi)皮、神經(jīng)等多種組織細(xì)胞。食管黏膜損傷如對骨髓MSC 具有招募和趨化性，哈偉杰等將MSC 注射到食管損傷的大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)MSC 大多分布在食管粘膜下層和基層內(nèi)，可以形成食管主要細(xì)胞［30］。Tan 將復(fù)合MSC 的小腸粘膜下層支架原位替換部分犬食管，術(shù)后4 周發(fā)現(xiàn)縫合處上皮層幾乎全部形成，且有成束的骨骼肌細(xì)胞，毛細(xì)血管密布［31］。P?unescu 等用上皮生長因子、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、干細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子-II 成功的將MSC 誘導(dǎo)成了食管上皮細(xì)胞［32］。Sarosi 等將MSC 經(jīng)尾靜脈注射到用致死量光照輻射的大鼠體內(nèi)，10 d 后大鼠隨機(jī)地接受反流式食管炎手術(shù)及食管空腸吻合手術(shù)，8 周后傷口處呈現(xiàn)出鱗狀上皮細(xì)胞和柱狀上皮細(xì)胞［33］。zhang 等在PLGA 材料上種植基因修飾的MSC，植入體內(nèi)4周后，免疫熒光顯示部分 MSC 分化為平滑肌細(xì)胞［34］。

2010 年，張波等灌注培養(yǎng)接種在HA/PLA(羥基磷灰石接枝聚乳酸)納米復(fù)合多孔支架上的MSC，15 d 后檢測到骨組織ALP 活性明顯增強(qiáng)［35］。Partridge 等將轉(zhuǎn)染了Ad-BMP -2 的MSC 與多孔的PLGA(聚乳酸羥基乙酸)復(fù)合培養(yǎng)6 周后，經(jīng)礦化物、堿性磷酸酶檢測證實(shí)MSC 已向成骨細(xì)胞分化并且可以維持成骨細(xì)胞表型;將細(xì)胞支架復(fù)合物移入動(dòng)物體內(nèi)也出現(xiàn)分化現(xiàn)象并產(chǎn)生了部分骨組織［36］。Gao 等將成軟骨條件誘導(dǎo)的大鼠骨髓MSC，復(fù)合透明質(zhì)酸或磷酸鈣的支架植入裸鼠背部皮下，一周后發(fā)現(xiàn)新生組織中含有Ⅰ、Ⅱ型膠原，認(rèn)為骨髓MSC結(jié)合相應(yīng)的支架材料可以分化出軟骨細(xì)胞構(gòu)建人工軟骨［37］。Kang 等將復(fù)合聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA 支架的MSC 移植到大鼠的脊椎損傷模型中，發(fā)現(xiàn)MSC 利用三維支架可以修復(fù)脊椎橫切面的損傷［38］。Sekiya 等的實(shí)驗(yàn)表明控制鎂離子濃度有效地促進(jìn)滑液MSC 向軟骨細(xì)胞分化［39］。Hwang 等將復(fù)合在聚乳酸或丙交酯和ε-己內(nèi)酯共聚物的高分子支架材料上的脂肪MSC 與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSC 可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖速度和基質(zhì)形成，而具有軟骨細(xì)胞的微環(huán)境則能夠誘導(dǎo)MSC 向軟骨細(xì)胞定向分化［40］。

李春明等將脂肪MSC 與絲素蛋白支架復(fù)合物移植到Wistar 大鼠后肢肌肉，8 周后發(fā)現(xiàn)支架網(wǎng)內(nèi)成脂樣細(xì)胞明顯增多并融合片狀生長［41］。Cui 和他的同事們將MSC 與D1 細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)地塞米松可以誘導(dǎo)MSC 向脂肪細(xì)胞分化［42］。Neubauer 等將接種在PLG 支架上的大鼠MSC 置于含bFGF 的培養(yǎng)基中一段時(shí)間后，在支架材料上檢測到了高密度的脂肪細(xì)胞和氫化酶［43］。

Wang 等將DAPI 標(biāo)記的鼠MSC 注入其他小鼠心肌中，術(shù)后檢測到MSC 向心肌細(xì)胞分化［44］。另外，Tang 和他的同事發(fā)現(xiàn)過量的旁分泌因子如SDF、VEGF、HGF 和IGF 促進(jìn)MSC 向心肌細(xì)胞的分化［45］。Quevedo 和Hatzistergos 將MSC 注射到心肌缺損模型中，術(shù)后一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)MSC 遷移到了損傷部位，其邊界分化出了心肌細(xì)胞，并且提高了射血分?jǐn)?shù)EF［46-47］。Shafy 等將MSC 種植到膠原蛋白包被的支架上，培養(yǎng)出了有節(jié)律跳動(dòng)的心肌細(xì)胞，移植到體內(nèi)同樣提高了EF，同時(shí)增強(qiáng)了心肌的收縮功能以及抵御心室壁的病理性減?。?8］。

Ishii 等將用含脂質(zhì)體的磁性納米顆粒培養(yǎng)的MSC 注射到后肢缺血模型的裸鼠中，術(shù)后檢測到新生血管中含有血管內(nèi)皮生長因子，同時(shí)恢復(fù)了血液循環(huán)［49］。Silva 等將MSC 注射到犬心臟后，觀察到大量叢生的血管，免疫組化檢測到上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等標(biāo)志性蛋白［50］。2008 年，Melero-Martin 將MSC 與血管內(nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)，一周后MSC 誘導(dǎo)分化形成了大量的血管細(xì)胞［51］。

Choong 等發(fā)現(xiàn)MSC 可以遷移到角膜組織中形成具有角膜基質(zhì)細(xì)胞表型的細(xì)胞［52］。Chen 等將骨髓MSC 靜脈注射到腦損傷模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，觀察到MSC 可以遷移至大腦，分化出神經(jīng)樣細(xì)胞［53］。Wang 等觀察到將MSC 復(fù)合到由羥基丁酸、羥基戊酸、羥基已酸三元共聚物的支架上可以促進(jìn)向神經(jīng)細(xì)胞的分化［54］。MSC 還可以成功誘導(dǎo)出許多其他類型的細(xì)胞，移植到體內(nèi)分化出皮膚、肺等多種組織。這些研究結(jié)果揭示MSC 完全可能作為組織工程的種子細(xì)胞用于各種組織器官的構(gòu)建和功能修復(fù)。

可是目前將間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床，仍有很多問題尚待解決:MSC 的分化進(jìn)程與其增殖能力負(fù)相關(guān);MSC 來源不一，這些細(xì)胞的增殖、分化能力也大不相同，幾次傳代后，這種差異尤其明顯，無法滿足組織工程細(xì)胞數(shù)量的要求。

3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

近些年的研究表明誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPS)是獲取組織工程種子細(xì)胞的另一新途徑，由于它不存在類似ESC 和MSC 的來源問題，成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。iPS 的生物學(xué)特性、增殖特點(diǎn)及分化潛能類似胚胎干細(xì)胞，可以由單個(gè)細(xì)胞分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層所有的細(xì)胞，進(jìn)而形成身體的所有組織和器官。2006 年Takahashi 將外源基因oct4、sox2、c-myc 和k1f4 導(dǎo)入皮膚成纖維細(xì)胞首次獲得了iPS，此成果被發(fā)表于當(dāng)年的Nature 上［55］。此后不同研究小組將其他許多細(xì)胞如肺成纖維細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、血液B 淋巴細(xì)胞等重編程后都得到了iPS。2012 年，徐清波等在重編程人皮膚細(xì)胞時(shí)更是將iPS 的獲取時(shí)間縮短為4 d［56］。

由于iPS 細(xì)胞巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，研究者們紛紛看好，并在短時(shí)間內(nèi)已經(jīng)取得了一系列突破。如Margariti 等從iPS 培育出了血管細(xì)胞，并注入肢體缺血的模型實(shí)驗(yàn)鼠中，形成了新的血管［56］。Lippmann 等將人iPS 和神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)于人工基底膜包被的培養(yǎng)板上誘導(dǎo)分化出了跨內(nèi)皮電阻達(dá)(1 450 ±140)Ω·cm2的血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞［57］。Nishimura 等將神經(jīng)細(xì)胞重編程的iPS 移植到小鼠耳內(nèi)，并成功發(fā)育成耳蝸毛細(xì)胞［58］。美國Herron 教授利用iPS 構(gòu)建了大量的類似于大多數(shù)人的靜息心率心肌細(xì)胞［59］。Duan 等將牙釉基質(zhì)衍生物和iPS 共同接種到牙周質(zhì)缺損處，發(fā)現(xiàn)新生的牙周膜連接牙槽骨和牙骨質(zhì)［60］。Bilousova 等將用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)的iPS 接種到明膠海綿支架上，并置于動(dòng)物體內(nèi)形成了功能性的成骨細(xì)胞［61］。Xu 等發(fā)現(xiàn)用膠原酶處理的iPS 經(jīng)EB 分化模式可以容易地在接枝明膠的支架上誘導(dǎo)出成纖維樣細(xì)胞［62］。

此外，iPS 還可以分化出大量的其他功能性細(xì)胞如造血細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等多種組織特異性細(xì)胞，這些研究成果充分證明iPS 可以作為組織工程研究中較為理想的種子細(xì)胞來源之一。但是iPS 也存在著自身的問題:研究還不夠全面;長期生物安全性有待綜合評價(jià);細(xì)胞來源不統(tǒng)一，與宿主的相容性尚待確定等。

4 問題與展望

大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)干細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件下可以分化為多種組織細(xì)胞，并且能夠修復(fù)損傷組織或促進(jìn)器官再生。因此，干細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞有望從根本上解決器官移植中的諸多問題，從而治療臨床上的多種疑難雜癥。然而想要干細(xì)胞真正應(yīng)用于臨床實(shí)踐還有許多困難需要克服:ESC 面臨著法律、倫理和道德問題，體外培養(yǎng)要求嚴(yán)格，向特定細(xì)胞分化機(jī)制不明，容易在體內(nèi)致瘤;MSC 治療適應(yīng)癥、診療時(shí)機(jī)選擇和作用機(jī)制不明朗;iPS 研究不夠深入，生物安全性尚且不明。但是我們相信隨著各種干細(xì)胞和生長因子應(yīng)用等技術(shù)的成熟，這些問題的解決將指日可待。

我們課題組以鐵系化合物為催化劑合成了一系列聚乳酸基可生物降解的低毒聚合物-以聚羥基乙酸PGA、聚L-乳酸、聚己內(nèi)酯以及它們的共聚物為基材對其進(jìn)行表面接枝改性，并運(yùn)用熱致相分離、電紡絲、自制模具等技術(shù)，獲得了幾種具有良好生物相容性的食道組織工程三維支架［63-65］，目前正應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，進(jìn)行深入的研究和探索，期待解決臨床上病變食管修復(fù)或再生的難題，從而最終實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)食管組織器官的夢想，造福于人類。

［1］ Chung BG，Lee KH，Khademhosseini A，et al． Microfluidic fabrication of microengineered hydrogels and their application in tissue engineering［J］. Lab on a Chip，2012，12(1):45 -59.

［2］ 楊照，周新民，樊代明，等. 生物型人工肝的新種子細(xì)胞來源-誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞［J］. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19(3):193 -195.

［3］ 歐來良，付曉玲，程兆康，等. 干細(xì)胞在心肌梗死治療中的應(yīng)用［J］. 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2006，25(6):786 -791.

［4］ Reubinoff BE，Pera MF，F(xiàn)ong CY，et al． Embryonic stem cell lines from human blastocysts:somatic differentiation in vitro［J］. Nature Biotechnology，2000，18(4):399 -404.

［5］ 張濤，阮狄克，王德利，等. 組織工程髓核種子細(xì)胞的研究進(jìn)展［J］. 中國脊柱脊髓雜志，2012，22(2):175 -178.

［6］ Ichida JK，Kiskinis E，Eggan K. Shushing down the epigenetic landscape towards stem cell differentiation ［J］. Development，2010，137(15):2455 -2460.

［7］ Evans MJ， Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos［J］. Nature，1981，292(5819):154 -156.

［8］ Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，1981，78(12):7634 -7638.

［9］ Nourse MB，Halpin DE，Scatena M，et al． VEGF Induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells implications for tissue engineering ［ J ］.Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2010，30(1):80 -89.

［10］ Li Zongjin，Suzuki Y，Huang Mei，et al． Comparison of reporter gene and iron particle labeling for tracking fate of human embryonic stem cells and differentiated endothelial cells in living subjects［J］. Stem Cells，2008，26(4):864 -873.

［11］ Xie Changqing，Zhang Jifeng，Villacorta L，et al． A highly efficient method to differentiate smooth muscle cells from human embryonic stem cells［J］. Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2007，27(12):1311 -1312.

［12］ 岳偉，曹誼林，張文杰. 從分化胚胎干細(xì)胞中分選血管構(gòu)建種子細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 2011，7(1):1 -5.

［13］ Bai Hao，Gao Yongxing，Arzigian M，et al． BMP4 regulates vascular progenitor development in human embryonic stem cells through a smad-dependent pathway［J］. Journal of Cellular Biochemistry，2009，109(2):363 -374.

［14］ Ferreira LS，Gerecht S，Shieh HF，et al． Vascular Progenitor Cells Isolated From Human Embryonic Stem Cells Give Rise to Endothelial and Smooth Muscle-Like Cells and Form Vascular Networks In Vivo［J］. Circulation Research，2007，101(3):286-294.

［15］ James D，Nam H，Seandel M，et al． Expansion and maintenance of human embryonic stem cell-derived endothelial cells by TGF -β inhibition is Id1 dependent［J］. Nature Biotechnology，2010，28(2):161 -166.

［16］ Pepe AE，Xiao Qingzhong，Zampetaki A，et al． Crucial role of nrf3 in smooth muscle cell differentiation from stem cells［J］.Circulation Research，2010，106(5):870 -879.

［17］ Blancas AA，Shih AJ，Lauer NE，et al． Endothelial cells from embryonic stem cells in a chemically defined medium［J］. Stem Cells and Development，2011，20(12):2153 -2161.

［18］ Descamps B， Emanueli C. Vascular differentiation from embryonic stem cells: Novel technologies and therapeutic promises［J］. Vascular Pharmacology，2012，56(3):267 -279.

［19］ Kane NM， Meloni M， Spencer HL， et al． Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation analysis of microRNA and angiogenesis In vitro and in vivo［J］. Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2010，30(7):1389 -1397.

［20］ Gold JD， Hassanipour M， Collins LR， et al. Direct differentiation method for making cardiomyocytes from human embryonic stem cells［P］.US Patent:7452718，2008 -11 -18.

［21］ Matsuura K，Masuda S，Haraguchi Y，et al． Creation of mouse embryonic stem cell-derived cardiac cell sheets ［J］.Biomaterials，2011，32(30):7355 -7362.

［22］ Mummery C，Ward-van Oostwaard D，Doevendans P，et al．Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes［J］. Circulation，2003，107(21):2733 -2740.

［23］ Willems E，Cabral-Teixeira J，Schade D，et al． Small moleculemediated TGF - β type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells［J］. Cell Stem Cell，2012，11(2):242 -252.

［24］ Ahmad S，Stewart R，Yung Sun，et al． Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche［J］. Stem Cells，2007，25(5):1145 -1155.

［25］ Akanuma H，Qin Xianyang，Nagano R，et al． Identification of stage-specific gene expression signatures in response to retinoic acid during the neural differentiation of mouse embryonic stem cells［J］. Frontiers in Genetics，2012，141(3):1 -12.

［26］ Bhatia M，Madrenas J，F(xiàn)erber IA，et al． Hematopoietic cells from human embryonic stem cells ［P］. European Patent Application :EP2292734，2011 -03 -09.

［27］ Toh WS，Lee EH，Cao Tong. Potential of human embryonic stem cells in cartilage tissue engineering and regenerative medicine［J］. Stem Cell Reviews and Reports，2011，7(3):544 -559.

［28］ Rankin S. Mesenchymal stem cells［J］. Thorax，2012，67(6):565 -566.

［29］ 李長文，鄭啟新，郭曉東，等. RGD 多肽修飾的改性PLGA仿生支架材料對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附，增殖及分化影響的研究［J］. 中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2006，25(2):142 -146.

［30］ 哈偉杰， 溫劍虎. 重組人表皮生長因子在食管黏膜損傷部位對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞招募及定居影響的研究［J］. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36(12):1423 -1426.

［31］ Tan Bo，Wei Renqian，Tan Meiyun，et al． Tissue engineered esophagus by mesenchymal stem cell seeding for esophageal repair in a canine model［J］. Journal of Research，2012，9(5):141 -149.

［32］ P?unescu V，Deak E，Herman D，et al． In vitro differentiation of human mesenchymal stem cells to epithelial lineage［J］. Journal of Cellular and Molecular Medicine，2007，11(3):502 -508.

［33］ Sarosi G，Brown G，Jaiswal K，et al． Bone marrow progenitor cells contribute to esophageal regeneration and metaplasia in a rat model of Barrett's esophagus［J］. Diseases of the Esophagus，2008，21(1):43 -50.

［34］ Zhang Jinqiu，Lian Qizhou，Zhu Guili，et al． A human iPSC model of Hutchinson Gilford Progeria reveals vascular smooth muscle and mesenchymal stem cell defects［J］. Cell Stem Cell，2011，8(1):31 -45.

［35］ 張波，權(quán)毅，謝慶云，等. 大鼠組織工程人工骨的體外動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)構(gòu)建［J］. 中國老年學(xué)雜志，2011，31(15):2932 -2933.

［36］ Partridge K，Yang Xuebin，Clarke NMP，et al．Adenoviral BMP-2 gene transfer in mesenchymal stem cells:In vitro and in vivo bone formation on biodegradable polymer scaffolds［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，2002，292(1):144-152.

［37］ Gao Jizong， Dennis JE， Solchaga LA， et al． Repair of osteochondral defect with tissue-engineered two-phase composite material of injectable calcium phosphate and hyaluronan sponge［J］. Tissue Engineering，2002，8(5):827 -837.

［38］ Kang KN，Kim DY， Yoon SM， et al． Tissue engineered regeneration of completely transected spinal cord using human mesenchymal stem cells［J］. Biomaterials，2012，33(19):4828-4835.

［39］ Sekiya I， Muneta T， Koga H， et al． Articular cartilage regeneration with synovial mesenchymal stem cells［J］. Clinical Calcium，2011，21(6):879 -890.

［40］ Hwang NS，Im SG，Wu PB，et al． Chondrogenic priming adipose-mesenchymal stem cells for cartilage tissue regeneration［J］. Pharmaceutical Research，2011，28(6):1395 -1405.

［41］ 李春明，劉毅，陳克明，等. 以PLGA 為支架的組織工程脂肪的實(shí)驗(yàn)研究［J］. 西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2007，28(1):3 -6.

［42］ Cui Q，Wang GJ，Balian G. Steroid-induced adipogenesis in a pluripotential cell line from bone marrow［J］.The Journal of Bone and Joint Surgery (American)，1997，79(7):1054 -63.

［43］ Neubauer M，Hacker M，Bauer-Kreisel P，et al． Adipose tissue engineering based on mesenchymal stem cells and basic fibroblast growth factor in vitro［J］. Tissue Engineering，2005，11(11 -12):1840 -1851.

［44］ Wang Tingzhong，Xu Zhengyun，Jiang Wenhui，et al． Cell-tocell contact induces mesenchymal stem cell to differentiate into cardiomyocyte and smooth muscle cell［J］. International Journal of Cardiology，2006，109(1):74 -81.

［45］ Tang Yaoliang，Zhao Qiang，Zhang Yaclare，et al． Autologous mesenchymal stem cell transplantation induce VEGF and neovascularization in ischemic myocardium ［J］. Regulatory Peptides，2004，117(1):3 -10.

［46］ Quevedo HC，Hatzistergos KE，Oskouei BN，et al. Allogeneic mesenchymal stem cells restore cardiac function in chronic ischemic cardiomyopathy via trilineage differentiating capacity［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106(33):14022 -14027.

［47］ Hatzistergos KE，Quevedo H，Oskouei BN，et al． Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Stimulate Cardiac Stem Cell Proliferation and DifferentiationNovelty and Significance［J］. Circulation Research，2010，107(7):913 -922.

［48］ Shafy A，F(xiàn)ink T，Zachar V，et al． Development of cardiac support bioprostheses for ventricular restoration and myocardial regeneration［J］. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery，2012，5(1)1 -9.

［49］ Ishii M，Shibata R，Numaguchi Y，et al． Enhanced angiogenesis by transplantation of mesenchymal stem cell sheet created by a novel magnetic tissue engineering method［J］. Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2011，31 (10):2210 -2215.

［50］ Silva GV，Litovsky S，Assad JAR，et al． Mesenchymal stem cells differentiate into an endothelial phenotype， enhance vascular density，and improve heart function in a canine chronic ischemia model［J］. Circulation，2005，111(2):150 -156.

［51］ Melero-Martin JM， De Obaldia ME， Kang SY， et al．Engineering robust and functional vascular networks In vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells［J］.Circulation Research，2008，103(2):194 -202.

［52］ Choong P，Mok P，Cheong S，et al． Mesenchymal stromal celllike characteristics of corneal keratocytes［J］. Cytotherapy，2007，9(3):252 -258.

［53］ Chen Chunjung，Ou Yechuan，Liao Sulan，et al． Transplantation of bone marrow stromal cells for peripheral nerve repair［J］.Experimental Neurology，2007，204(1):443 -453.

［54］ Wang Lei，Wang Zhihui，Shen Chongyong，et al． Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells grown in terpolyesters of 3 - hydroxyalkanoates scaffolds into nerve cells［J］. Biomaterials，2010，31(7):1691 -1698.

［55］ Takahashi K，Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］. Cell，2006，126(4):663 -676.

［56］ Margariti A， Winkler B， Karamariti E， et al． Direct reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capable of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109(34):13793 -13798.

［57］ Lippmann ES，Azarin SM，Kay JE，et al. Derivation of bloodbrain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells［J］. Nature Biotechnology，2012，30(10):783 -791.

［58］ Nishimura K，Nakagawa T，Ono K，et al． Transplantation of mouse induced pluripotent stem cells into the cochlea［J］.Neuroreport，2009，20(14):1250 -1254.

［59］ Herron TJ，Lee P，Jalife J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells ＆ tissues［J］. Circulation Research，2012，110(4):609 -623.

［60］ Duan Xuejing，Tu Qisheng，Zhang Jin，et al． Application of induced pluripotent stem (iPS) cells in periodontal tissue regeneration［J］. Journal of Cellular Physiology，2011，226(1):150 -157.

［61］ Bilousova G，Jun DH，King KB，et al． Osteoblasts derived from induced pluripotent stem cells form calcified structures in scaffolds both in vitro and in vivo［J］. Stem Cells，2011，29(2):206 -216.

［62］ Xu Chunhui，Jiang Jianjie，Sottile V，et al． Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth［J］. Stem Cells，2004，22(6):972 -980.

［63］ 雷鈺娜，竺亞斌，陳玲，等. 鐵系化合物催化脂肪族環(huán)酯聚合反應(yīng)［J］. 功能高分子學(xué)報(bào)，2011，24(3):297 -302.

［64］ 竺亞斌，劉玉新. 熱致相分離法制備食道組織工程用支架的研究［J］. 寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理 工版)，2008，21(2):240 -245.

［65］ 竺亞斌，李媛媛，劉玉新. 電紡絲復(fù)合纖維的制備及其影響因素探討［J］. 寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版)，2009，22(3):408-413.