謝 芳，賴衛(wèi)華,*，史愛武，鄧省亮，熊勇華，余揚(yáng)帆

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司，江蘇 無錫 214000；3.江西省科學(xué)院微生物研究所，江西 南昌 330029)

黃曲霉毒素是真菌的次級代謝產(chǎn)物，主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和特曲霉(Aspergillus nomius)產(chǎn)生[1-2]。黃曲霉毒素主要存在于土壤、動植物、各種堅(jiān)果、特別是花生和核桃中。在大豆、稻谷、玉米、通心粉、調(diào)味品、牛奶及奶制品、醬油、食用油等制品中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素[3-6]。在所有的真菌毒素中，黃曲霉毒素Bl(aflatoxin B1，AFB1)的毒性、致癌性、致突變性、致畸性均居首位[7-10]。AFB1是目前化學(xué)致癌物中最強(qiáng)的一種致癌誘變劑，其毒性比氰化鉀強(qiáng)10倍，比砒霜強(qiáng)68倍；其致癌性比二甲基亞硝胺強(qiáng)75倍，比二甲基偶氮苯強(qiáng)900倍。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物[11]。1966年WHO/FAO首次規(guī)定了食品中黃曲霉毒素最高允許量，明確規(guī)定谷物中AFB1的含量不得超過20μg/kg，否則將禁止投放市場[12]。AFB1污染遍布世界各地，在熱帶和亞熱帶地區(qū)尤為嚴(yán)重，而且熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，一般的烹調(diào)溫度對其破壞很少[13]。

目前食品中AFB1的主要提取方法包括有機(jī)溶劑萃取法、免疫親和層析法等。有機(jī)溶劑萃取法是目前最普遍的提取方法，但有機(jī)溶劑的萃取存在過程復(fù)雜、毒性大、所需時間長等缺點(diǎn)，而且由于最終提取物中可能存在其他熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物，從而對檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾[14]。免疫親和層析提高了試樣的凈化效果，同時可顯著減少有毒有害試劑的使用，但樣品前處理較復(fù)雜，價格昂貴。

免疫磁珠分離技術(shù)可將分離與富集結(jié)為一體，因此具有高效、快速和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。免疫磁珠的富集凈化包括吸附和洗脫兩個過程，吸附是免疫磁珠和樣品中的待測物之間的特異性結(jié)合，而洗脫是用有機(jī)溶劑將吸附在免疫磁珠上的待測物洗下來，與磁珠分離[15-16]。免疫磁珠富集凈化作為一種前處理手段可避免傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，它不僅可以減少有毒有害試劑的使用，提高試樣的凈化效果，而且所需設(shè)備簡單，操作簡便。目前國內(nèi)外尚未見以免疫磁珠富集凈化結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附法檢測醬油基質(zhì)中的AFB1的報道。本實(shí)驗(yàn)擬建立以免疫磁珠富集凈化結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附法檢測醬油基質(zhì)中的AFB1的方法，以期為檢測醬油基質(zhì)中的AFB1提供一種有效的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AFB1美國Sigma公司；PM3-020(粒徑180nm)、SM3-P100(粒徑1150nm)羧基化磁珠 上海奧潤微納新材料科技有限公司；特級金標(biāo)醬油 佛山海天調(diào)味食品股份有限公司；AFB1酶聯(lián)免疫試劑盒 無錫中德伯爾生物技術(shù)有限公司；Micro BCATMProtein Assay Kit 美國Pierce生物技術(shù)有限公司；三氯甲烷、甲醇、無水硫酸鈉(AR級) 國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6102電子精密天平 余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；DK-S22數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZDP-A2160恒溫培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；DNM-9602酶標(biāo)測定儀 北京普朗新技術(shù)有限公司；BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜 蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司；H-7500型透射電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 磁珠的表征

利用透射電子顯微鏡對所用的磁珠粒子進(jìn)行形貌和分散性分析。

1.3.2 磁珠與抗體的偶聯(lián)

1.3.2.1 偶聯(lián)步驟

1)清洗：分別取5mg羧基化磁珠于5mL離心管中，2mL PB(0.02mol/L，pH6.0)洗2次，洗滌后用2mL MES(0.05mol/L，pH6.0)重懸；2)活化：超聲使磁珠分散，再分別加入1mg EDC，1mg NHSS(用0.05mol/L、pH6.0的MES溶解)，25℃活化2h，15r/min旋轉(zhuǎn)保持懸浮狀態(tài)；3)偶聯(lián)：磁分離，吸去上清液，2mL PB(0.02mol/L，pH7.4)洗滌一次并轉(zhuǎn)移至新的離心管，3mL PB(0.02mol/L，pH7.4)重懸，超聲使磁珠分散。再分別將275μg辛酸-硫酸銨法[17]純化的抗AFB1單克隆抗體加入到已活化磁珠中，25℃偶聯(lián)3h，15r/min旋轉(zhuǎn)保持懸浮狀態(tài)；4)封閉：磁分離，取出上清液(上清液中的蛋白含量待檢)，加入1mg/mL乙醇胺及1mg/mL BSA封閉(用0.02mol/L、pH7.4的PB溶解，并調(diào)節(jié)pH值至中性)，25℃封閉2h，15r/min旋轉(zhuǎn)保持懸浮狀態(tài)；5)保存：0.01mol/L PBS洗滌磁珠2次，磁分離，去上清液，用3mL pH7.4 PB(0.02mol/L，含0.02%NaN3和0.5%BSA)重懸，存于4℃。

1.3.2.2 免疫磁珠偶聯(lián)率的分析

通過Micro BCATMProtein Assay Kit測量562nm波長處的OD值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測偶聯(lián)后上清液中剩余的抗體量，間接計(jì)算出偶聯(lián)到磁珠表面的抗體量，然后根據(jù)公式計(jì)算抗體偶聯(lián)率。

1.3.2.3 抗體與磁珠偶聯(lián)條件的優(yōu)化

1)偶聯(lián)液的優(yōu)化：取已活化的180nm磁珠2mg，加入單克隆抗體150μg，分別以去離子水(pH8.0)、PB(0.02mol/L，pH8.0)、PBS(0.01mol/L，pH8.0)、碳酸鹽緩沖液(0.05mol/L，pH8.0)作為偶聯(lián)反應(yīng)體系，比較抗體偶聯(lián)率。

2)偶聯(lián)緩沖液pH值的優(yōu)化：取已活化的180nm磁珠2mg，加入單克隆抗體150μg，以3種不同pH值的緩沖液作為偶聯(lián)反應(yīng)液，分別為pH7.4、8.4、9.6的0.02mol/L PB，比較抗體偶聯(lián)率。

3)抗體加入量的優(yōu)化：取已活化的180nm磁珠2mg，分別加入35、50、65、80、95、110、125、140、155、170μg單克隆抗體，在最佳的緩沖體系中進(jìn)行偶聯(lián)，比較抗體偶聯(lián)量。

1.3.3 免疫磁珠富集AFB1

1.3.3.1 免疫磁珠富集AFB1步驟

1)上樣：取0.5mg免疫磁珠，磁力架分離，用0.01mol/L、pH7.4 PBS洗滌2次，加入適量AFB1，并使最終體積為3mL，甲醇含量為20%，25℃反應(yīng)1h，15r/min旋轉(zhuǎn)保持懸浮狀態(tài)；2)洗滌：磁力架分離，1mL 20%甲醇溶液洗滌1次，收集上清液與洗滌液，存放于4℃，以備酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測；3)洗脫：用400μL純甲醇洗脫2次(200μL/次，3min/次)，收集洗脫液，存放于4℃，以備ELISA檢測。

1.3.3.2 免疫磁珠富集AFB1條件的優(yōu)化

AFB1難溶于水，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑，但甲醇等有機(jī)溶劑會對免疫磁珠表面的抗體活性造成影響。本實(shí)驗(yàn)對免疫磁珠富集AFB1的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇含10%、15%、20%、25%甲醇的0.01mol/L PBS作為富集反應(yīng)體系，采用0.5mg的免疫磁珠，對5ng的AFB1進(jìn)行富集實(shí)驗(yàn)，比較各體系對AFB1的回收率。

1.3.3.3 免疫磁珠的最佳使用量

采用1g醬油作為食品基質(zhì)，添加5ng的AFB1(依據(jù)GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》)。為了選擇最佳免疫磁珠的用量，本實(shí)驗(yàn)對免疫磁珠的用量進(jìn)行了優(yōu)化，選擇0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg的免疫磁珠在含20%甲醇的PBS中富集5ng的AFB1，比較其對AFB1的回收率。

1.3.3.4 不同粒徑的免疫磁珠對AFB1富集效果的比較

180nm和1150nm羧基化超順磁珠通過EDC，NHSS活化后，與抗AFB1單克隆抗體偶聯(lián)得到AFB1免疫磁珠。分別取0.5mg大小粒徑的免疫磁珠富集5ng的AFB1，通過偶聯(lián)率及回收率來比較富集效果。

1.3.4 在醬油中的應(yīng)用

1.3.4.1 不同稀釋度醬油中AFB1富集效果的比較

鑒于醬油中鹽離子濃度對免疫磁珠活性的干擾，對醬油進(jìn)行了簡單的前處理，用蒸餾水和甲醇分別將1g陰性醬油稀釋成含20%甲醇的1、1.5、3mL體系。采用0.5mg免疫磁珠對5ng的AFB1進(jìn)行富集凈化實(shí)驗(yàn)，比較其對AFB1的回收率。

1.3.4.2 0.5mg免疫磁珠富集不同AFB1含量的醬油

取適量AFB1陰性醬油，分別添加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品使其最終質(zhì)量濃度達(dá)1、3、5、7μg/kg。均采用0.5mg免疫磁珠，按照已優(yōu)化的方法進(jìn)行富集實(shí)驗(yàn)，比較對AFB1的回收率。

1.3.5 醬油樣品中前處理方式的比較

取適量AFB1陰性醬油，添加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品使其最終質(zhì)量濃度達(dá)5μg/kg。分別按照本實(shí)驗(yàn)已優(yōu)化的免疫磁珠富集法和GB/T 5009.22—2003《食品中黃曲霉毒素Bl的測定》的方法進(jìn)行AFB1的提取，再用AFB1酶聯(lián)免疫吸附法檢測，比較方法的優(yōu)越性

1.3.5.1 免疫磁珠富集法

根據(jù)GB 2761—2011添加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品：上樣：稱取1.00g陰性醬油于5mL離心管中，加入5ng AFB1標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，使最終體積為3mL，甲醇含量為20%，振蕩混勻。同時將制備好的0.5mg免疫磁珠用0.01mol/L pH7.4 PBS洗滌2次，將已稀釋好的醬油加入到免疫磁珠中；洗滌：磁力架分離，1mL 20%甲醇溶液洗滌1次，收集上清液與洗滌液，存放于4℃，以備ELISA檢測；洗脫：用400μL純甲醇洗脫2次(200μL/次，3min/次)，收集洗脫液，存放于4℃，以備ELISA檢測。

1.3.5.2 GB/T 5009.22—2003方法測定

根據(jù)GB 2761—2011添加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，按照GB/T 5009.22—2003對10.00g醬油進(jìn)行有機(jī)溶劑提取。

1.3.6 AFB1酶聯(lián)免疫試劑盒檢測

加樣：每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液或提取完成的待檢樣品50μL，然后每孔分別加入AFB1標(biāo)記HRP溶液50μL；溫育：輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置于37℃避光靜置30min；洗滌：小心揭開封板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入1×洗滌液250μL/孔，充分洗滌3次，用吸水紙拍干；顯色：底物溶液A和底物溶液B按體積比1∶1混合，輕輕振蕩混勻，每孔加入混合后的底物溶液100μL，37℃避光顯色15min；測定：每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩混勻，5min內(nèi)測定450nm波長處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超順磁珠的表征

將購買的1150nm和180nm粒徑的羧基化超順磁珠在透射電子顯微鏡下觀察，1150nm和180nm磁珠電鏡圖的比例分別是1∶8000及1∶35000，由圖1可知，大小粒徑的磁珠粒子均呈圓形，單分散性較好。

圖1 FFee3O4磁珠的電鏡圖Fig.1 TEM micrograph of Fe3O4 magnetic beads

2.2 抗體與磁珠偶聯(lián)條件的優(yōu)化

2.2.1 偶聯(lián)液的優(yōu)化

圖2 不同反應(yīng)液的抗體偶聯(lián)率Fig.2 Antibody-coupling efficiency in different buffers

不同反應(yīng)體系的抗體偶聯(lián)率如圖2所示，PB緩沖液的偶聯(lián)效果最好，所以選0.02mol/L PB作為偶聯(lián)反應(yīng)液。

2.2.2 偶聯(lián)緩沖液pH值的優(yōu)化

由圖3可知，pH7.4的PB緩沖液偶聯(lián)效果最好，所以選pH7.4 0.02mol/L PB作為偶聯(lián)緩沖液。

圖3 不同pH值緩沖液的抗體偶聯(lián)率Fig.3 Antibody-coupling efficiency in PB buffer at different pH values

2.2.3 抗體加入量的優(yōu)化

圖4 抗體加入量對偶聯(lián)效果的影響Fig.4 Effect of antibody amount on conjugation efficiency

由圖4可知，當(dāng)抗體量加入在35～110μg之間時，偶聯(lián)上的抗體量逐漸增加，當(dāng)加入的抗體量大于110μg時，偶聯(lián)上的抗體量趨向飽和，所以2mg磁珠的最佳抗體加入量為110μg，偶聯(lián)上的抗體量為76.7μg。

2.3 免疫磁珠富集AFB1條件的優(yōu)化

在不同甲醇體積分?jǐn)?shù)的富集條件下，對AFB1回收率如圖5所示，甲醇體積分?jǐn)?shù)在20%左右時富集效果最好，所以在本實(shí)驗(yàn)中采用含20%甲醇的富集體系。

圖5 甲醇體積分?jǐn)?shù)對富集AFB1的影響Fig.5 Effect of methanol concentration on aflatoxin B1 enrichment

2.4 免疫磁珠的最佳使用量

不同磁珠用量對AFB1的回收率如圖6所示，當(dāng)免疫磁珠的加入量為0.3～0.5mg時，AFB1的回收率逐步上升，能達(dá)到98.2%，當(dāng)加入的免疫磁珠用量大于0.5mg時，回收率基本趨于飽和。所以選擇免疫磁珠0.5mg為最佳使用量。

圖6 免疫磁珠用量對AFB1富集的影響Fig.6 Effect of IMB (immunomagnetic bead) amount on aflatoxin B1 enrichment

2.5 不同粒徑的免疫磁珠對AFB1富集效果的比較

表1 免疫磁珠的抗體偶聯(lián)率及對AFB1的回收率Table 1 Antibody-coupling efficiency of IMBs of different sizes and average recovery rate of aflatoxin B1

由表1可知，雖然兩種免疫磁珠的抗體偶聯(lián)率相差不大，但180nm的免疫磁珠對AFB1的富集效果遠(yuǎn)高于1150nm的免疫磁珠?？赡茉蚴切×酱胖榈谋缺砻娣e更大，所能結(jié)合反應(yīng)的位點(diǎn)更多。所以本實(shí)驗(yàn)選擇180nm的磁珠。

2.6 不同稀釋度醬油中AFB1富集效果的比較

圖7 不同稀釋度對富集醬油中AFB1的影響Fig.7 Effect of different dilution ratios on aflatoxin B1 enrichment

由圖7可知，3種體系中3mL體系的富集效果最好，所以在醬油中選用含20%甲醇的3mL體系。

2.7 0.5mg免疫磁珠富集不同AFB1含量的醬油

圖8 免疫磁珠富集AFB1的回收率Fig.8 Recovery rates of AFB1 by IMBs

由圖8可知，其平均加標(biāo)回收率分別為90%、96%、104%、83.6%，計(jì)算出相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為7.2%、9.4%、12.8%、13.7%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果并綜合考慮，0.5mg的免疫磁珠富集AFB1的柱容量為5ng左右。

2.8 醬油中兩種不同前處理方式的比較

2.8.1 免疫磁珠富集法

按照已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，得其平均加標(biāo)回收率為104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.8%。

2.8.2 GB/T 5009.22—2003的方法

得其平均加標(biāo)回收率為49%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以ELISA作為檢測方法，免疫磁珠的富集凈化方法優(yōu)于GB/T 5009.22—2003的有機(jī)溶劑提取的方法。

2.9 酶聯(lián)免疫吸附法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將質(zhì)量濃度為0、0.05、0.15、0.3、0.9、2.7ng/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液加到酶標(biāo)板的孔中，測定吸光度。百分吸光度按下式計(jì)算：

百分吸光度/%=B/B0×100

式中：B為所測得的標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的平均值；B0為第1個標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度。

以AFB1標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為X軸，對應(yīng)的百分吸光度為Y軸，如圖9所示。該曲線在0.05～0.3μg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9842，同時該檢測方法的靈敏度較高，為0.05μg/kg，可滿足實(shí)際檢測需要。

圖9 AFB1酶聯(lián)免疫吸附法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Calibration curve of AFB1 ELISA Kit

3 討論與結(jié)論

目前在大豆釀造醬油及各種醬油制品中均存在不同程度的AFB1污染。孫秀蘭等[18]對我國5個省中203個醬油樣品中的AFB1含量進(jìn)行了檢測，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)AFB1普遍存在于醬油產(chǎn)品中，少數(shù)樣品中AFB1含量較高，已接近歐盟標(biāo)準(zhǔn)2μg/kg。徐丹等[19]對釀造醬油生產(chǎn)過程中AFB1的動態(tài)變化進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)醬油中AFB1有50%是由生產(chǎn)原料帶來的，剩下50%是在制曲過程中產(chǎn)生的污染，雖然蒸煮、制曲、發(fā)酵、淋油4階段均對AFB1有一定的去除作用，但生產(chǎn)結(jié)束后仍有52.04%的AFB1轉(zhuǎn)移到成品醬油中。這種污染在傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中很常見，所以在醬油中建立一種快速檢測AFB1的方法具有重要意義。

針對目前醬油中AFB1的含量及檢測現(xiàn)狀，本實(shí)驗(yàn)初步建立了以免疫磁珠富集凈化，聯(lián)合酶聯(lián)免疫試吸附法檢測醬油基質(zhì)中的AFB1的方法。該方法具有操作簡便、設(shè)備簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，加標(biāo)回收率為83.6%～104%，所需時間在2.5h以內(nèi)，可很好地應(yīng)用于醬油中AFB1的快速檢測，結(jié)果表明該方法優(yōu)于GB/T 5009.22—2003中有機(jī)溶劑提取的方法，而且減少了有機(jī)溶劑的使用。劉偉偉等[20]利用免疫磁珠體系對植物油中的AFB1進(jìn)行了檢測的研究，平均回收率可達(dá)96%。

通過不同粒徑的免疫磁珠富集效果的比較，發(fā)現(xiàn)小粒徑磁珠的富集效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于大粒徑磁珠，其可能原因是小粒徑磁珠的比表面積更大，所能結(jié)合的位點(diǎn)更多，這使得小粒徑磁珠的應(yīng)用將具有更大的潛能。通過實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，含20%甲醇的反應(yīng)液作為吸附體系具有很好的富集效果，這與AFB1本身的屬性和免疫磁珠的活性有關(guān)，AFB1難溶于水，易溶于甲醇等有機(jī)溶劑，但有機(jī)溶劑對免疫磁珠表面的抗體活性影響很大，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，20%的甲醇既能讓AFB1充分溶解，保持原有的分子結(jié)構(gòu)，同時也不會讓免疫磁珠表面的抗體活性受到很大的影響。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，磁珠在操作過程中容易產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，這對其反應(yīng)活性產(chǎn)生了很大的影響，使部分磁珠的活性不能得到充分的利用，本實(shí)驗(yàn)所采用的方法是適當(dāng)超聲，可以使磁珠粒子得到很好的分散。醬油中的鹽離子濃度較高，對實(shí)驗(yàn)的影響很大，本實(shí)驗(yàn)通過稀釋來減少基質(zhì)的干擾，使富集效果得到改善。

[1]LEONTOPOULOS D, SIAFAKA A, MARKAKI P. Black olives as substrate forAspergillus parasiticusgrowth and aflatoxin B1production[J]. Food Microbiology, 2003, 20(1)∶ 119-126.

[2]YU J, BHATNAGAR D, CLEVELAND T E. Completed sequence of aflatoxin pathway gene cluster inAspergillus parasiticus[J]. Federation of European Biochemical Societies, 2004, 564(1/2)∶ 126-130.

[3]徐洲, 譚書明, 焦彥朝, 等. 酶聯(lián)免疫法測定干辣椒中的黃曲霉毒素B1[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(10)∶ 245-247.

[4]江湖, 熊勇華, 許楊, 等. EDC法制備黃曲霉毒素B1人工抗原的研究[J]. 食品科學(xué), 2005, 26(7)∶ 125-128.

[5]王艷霞. 基于磁性微粒的黃曲霉毒素樣本凈化及層析試紙條研究[D]. 西安∶ 西北大學(xué)，2012.

[6]吳丹. 黃曲霉毒素在糧食和食品中的危害及防治[J]. 糧食加工,2007, 32(3)∶ 91-94.

[7]孫武長, 劉桂華, 楊紅, 等. 糧食中真菌及真菌毒素污染調(diào)查[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2005, 21(12)∶ 1532.

[8]PETZINGER E, WEIDENBACH A. Mycotoxins in the food chain∶ the role of ochratoxins[J]. Livestock Production Science, 2002, 76(3)∶ 245-250.

[9]PETZINGER E, ZIEGLER K. Ochratoxin A from a toxicological perspective[J]. Vet Pharmacol, 2000, 23(2)∶ 91-98..

[10]STUDER-ROHR I, DIETRICH D R, SCHLATTER J, et al. The occurrence of ochratoxin in coffee[J]. Food Chem Toxicol, 1995,33(5)∶ 341-355.

[11]ELISABETE Y S. Evaluation of fumonisin-aflatoxin co-occurrence in Brazilian corn hybrids by ELISA[J]. Food Additives and Contaminants, 2001, 18(8)∶ 719-729.

[12]王彩云, 王政綱, 云戰(zhàn)友. 酶聯(lián)免疫法測定食品和飼料中的黃曲霉毒素[J]. 食品工程, 2007(4)∶ 58-60.

[13]鄧省亮. 黃曲霉毒素B1膠體金免疫層析快速檢測方法的研究[D]. 南昌∶ 南昌大學(xué), 2006.

[14]孫秀蘭, 趙曉聯(lián), 湯堅(jiān). 大米中黃曲霉毒素B1的提取方法優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(7)∶ 128-131.

[15]喻偉. 免疫磁珠的制備及其初步應(yīng)用[D]. 武漢∶ 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010.

[16]余曉峰, 張萍, 宗凱, 等. 免疫磁珠法檢測脫水蒜制品中沙門氏菌[J].食品科學(xué), 2012, 33(24)∶ 257-259.

[17]陳丹, 孫廣瑞, 柳增善. 辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法在單克隆抗體純化中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(26)∶ 8105-8108.

[18]孫秀蘭, 晏麗, 徐丹, 等. 醬油中黃曲霉毒素B1的風(fēng)險評估[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2010, 22(8)∶ 748-753.

[19]徐丹, 王洪新, 張銀志. 低鹽固態(tài)釀造醬油生產(chǎn)過程中黃曲霉毒素B1和微生物的動態(tài)變化[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2011, 30 (6)∶ 905-910.

[20]劉偉偉, 孫秀蘭, 張銀志. 超順磁性免疫磁珠體系應(yīng)用于植物油中黃曲霉毒素B1的檢測研究[J]. 分析測試學(xué)報, 2011, 30(12)∶ 1345-1350.