張世仙，劉 焱，朱 彬，金 茜，曾啟華

(遵義師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，黔北特色資源應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563002)

多糖是由10個以上的單糖分子通過糖苷鍵結(jié)合而成的物質(zhì)，多糖是一切有生命的有機(jī)體必不可少的成分，是構(gòu)成動植物骨架結(jié)構(gòu)的組成成分，多糖與維持生命的種種生理機(jī)能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)多糖能控制細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長與衰老，有些多糖具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血壓、鎮(zhèn)痛、抗輻射等藥效[1-5]。貴州省是釀酒大省，大多數(shù)白酒是用當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的高粱和小麥為原料通過酒曲發(fā)酵而成，其最大副產(chǎn)物——酒糟中殘存著大量的多糖、被富集的蛋白質(zhì)、礦物元素等營養(yǎng)物質(zhì)[6-7]，是提取酒糟多糖的較好原料。

對多糖的定量測定可以采用兩種方法[8-17]：一是利用多糖中的還原糖與試劑發(fā)生氧化還原反應(yīng)顯色測定，如3,5-二硝基水楊酸鹽(DNS)比色法和Somogyi-Nelson法；二是將多糖在強(qiáng)酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，再與酚類或胺類化合物縮合，生成有特殊顏色的物質(zhì)進(jìn)行測定，如苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法。其中苯酚-硫酸法是常用的一種經(jīng)典方法，但是苯酚毒性大、易氧化，其提純操作較難控制，文獻(xiàn)[18]報道用萘酚-硫酸法測定白果多糖的含量，方法可行和容易操作。本實(shí)驗(yàn)嘗試用a-萘酚-硫酸法測定酒糟多糖的含量，以建立酒糟多糖含量的測定方法和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

酒糟 貴州省某酒廠提供；α-萘酚(分析純) 湘中化學(xué)試劑開發(fā)中心；葡萄糖(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇(分析純)、濃硫酸(分析純) 成都市科龍化工試劑廠。

722型分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TB-214型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；pHS-2C型精密酸度計 上海大普儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；0412-1型離心機(jī)上海手術(shù)器械廠；真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司。

1.2 方法

1.2.1 酒糟多糖的提取工藝[19-22]

新鮮酒糟粉→在料水比1∶12條件下，用鹽酸調(diào)pH值至5.0～5.5→控制溫度用水解蛋白酶降解酒糟中的蛋白質(zhì)→離心→pH值調(diào)至中性→濃縮→4倍體積95%乙醇沉淀→靜置→過濾→冷凍干燥→酒糟多糖

1.2.2 溶液配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用二次蒸餾水定容至500mL，即得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

樣品溶液：精密稱取樣品0.2200g，用二次蒸餾水定容至50mL，移取10mL，用二次蒸餾水定容至100mL，即為0.44mg/mL待測樣品溶液。

1.5g/100mLα-萘酚溶液：準(zhǔn)確稱取1.5gα-萘酚，用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液溶解并定容至100mL，即為1.5g/100mLα-萘酚溶液，轉(zhuǎn)移至棕色瓶，于4℃冰箱保存、備用。

1.2.3 最大吸收波長確定

準(zhǔn)確移取1mL 0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL比色管中，加入1mL 1.5g/100mL的α-萘酚溶液，搖勻并迅速加入5mL濃硫酸，充分混合，室溫放置至無氣泡后(約20min)，在410～710nm波長區(qū)域測定吸光度，并以試劑空白為對照。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10、15、20、30、35、40、45mL于50mL容量瓶中定容，得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，于560nm波長處，以試劑空白為參比測吸光度。

1.2.5 換算因子的測定[12-14]

準(zhǔn)確移取1.2.2節(jié)中的樣品溶液1mL，用二次蒸餾水定容于10mL容量瓶中。取1.0mL溶液5份，按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，測定吸光度，由回歸方程計算多糖中葡萄糖平均含量，按下式(1)計算出換算因子f。

式中：m為多糖質(zhì)量/mg；ρ為樣品溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度/(μg/mL)；D為多糖的稀釋倍數(shù)；V為體積/mL。

1.2.6 樣品測定

準(zhǔn)確移取1mL質(zhì)量濃度為0.44mg/mL樣品溶液3份，按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，測定吸光度，由回歸方程計算葡萄糖含量，按式(2)計算得出酒糟多糖含量。

式中：W為樣品的質(zhì)量/mg；其他量符號含義同式(1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長確定

取一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)所得的吸收曲線見圖1。從圖1可見，最大吸收峰波長為560nm。

圖1 α-萘酚-硫酸法確定多糖最大吸收波長Fig.1 The maximum absorption wavelength for naphthol-vitriol photometric determination of polysaccharide

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

根據(jù)1.2.4節(jié)方法，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.0255ρ＋0.0419，R2=0.9975，葡萄糖在6～36μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。

2.3 測定方法的考察

2.3.1 顯色時間的確定

準(zhǔn)確移取1mL樣品溶液，按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，每隔10min測定1次吸光度，連續(xù)測定50min，結(jié)果見圖2。

圖2 顯色時間對吸光度的影響(n=3)Fig.2 Effect of coloration time on absorbance (n=3)

由圖2可見，冷卻至室溫后的20min內(nèi)吸光度很穩(wěn)定，30min后吸光度雖然有所下降，但下降趨勢不明顯，因此按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)的時間控制在20min之內(nèi)。

2.3.2α-萘酚溶液添加量的確定

在盛有1.0mL一定質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的5支比色管中，各加入1.0mL二次蒸餾水和1.5g/100mL的α-萘酚溶液0.2、0.6、0.8、1.0、1.2mL，再分別加入2.5mL濃硫酸，另取一支比色管作空白，按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)并測定吸光度。結(jié)果表明，當(dāng)1.5g/100mL的α-萘酚溶液加入量為1.0mL時，吸光度較大，見圖3。

圖3 α-萘酚添加量對吸光度的影響Fig.3 Effect of α-naphthol dosage on absorbance

2.3.3α-萘酚溶液質(zhì)量濃度的確定

取6支比色管，分別加入1.0mL一定質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入質(zhì)量濃度為0、0.500、0.750、0.875、1.500、1.750g/100mL的α-萘酚溶液，按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)并測定吸光度。結(jié)果表明，使用1.500g/100mLα-萘酚溶液，吸光度最大，見圖4。

圖4 α-萘酚質(zhì)量濃度對吸光度的影響Fig.4 Effect of α-naphthol concentration on absorbance

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確移取1mL 一定質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于11支比色管中，加雙蒸水1.0mL，再加入1.0mL 1.5g/100mL的α-萘酚溶液，按1.4.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，連續(xù)測定11次，得吸光度分別為0.904、0.898、0.900、0.900、0.898、0.899、0.901、0.900、0.899、0.900、0.899，計算RSD為0.18%。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取1mL 0.44mg/mL的樣品溶液于8支比色管，按1.2.2節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，得吸光度分別為0.686、0.686、0.685、0.684、0.686、0.686、0.684、0.685，計算RSD為0.14%。

2.4.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取2mL 0.44mg/mL的樣品溶液于10mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容至刻度，取1mL按1.2.3節(jié)方法實(shí)驗(yàn)，測得吸光度，換算含糖量平均值為0.945μg/mL。再取4支10mL容量瓶，各加入2mL該樣品溶液，并分別加入一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用二次蒸餾水定容至刻度，取1mL按1.2.3節(jié)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 回收率測定結(jié)果(n=4)Table 1 Recovery rates of glucose from spiked sample (n=4)

從表1可見，平均回收率為100.65%，RSD為6.5%。2.4.4 換算因子的測定

實(shí)驗(yàn)測得1.2.5節(jié)中樣品溶液的吸光度為0.585、0.585、0.593、0.588、0.586。由回歸方程計算出酒糟多糖中葡萄糖平均含量為21.392μg/mL，按換算因子公式計算出f＝2.057(n=5)。

2.5 樣品測定

將1.2.6節(jié)實(shí)驗(yàn)測得的吸光度代入回歸方程計算葡萄糖含量，再通過多糖含量公式計算得出酒糟多糖平均含量為10.6%，RSD為4.0%(n=3)。

3 結(jié) 論

α-萘酚-硫酸法測定酒糟多糖含量實(shí)驗(yàn)表明：樣品與5mL濃硫酸反應(yīng)，用1.5g/100mLα-萘酚1.0mL顯色，于560nm波長處測定其吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，回收率較高。

α-萘酚-硫酸法與常用的苯酚-硫酸法相比，測定酒糟多糖含量的步驟基本一致，但是α-萘酚-硫酸法在操作、試劑消耗等方面更具優(yōu)勢，適合酒糟多糖含量的測定。

[1]張惟杰. 復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M]. 上?！?上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1987∶ 124-178.

[2]陳惠黎, 王克夷. 糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能[M]. 上海∶ 上海醫(yī)科大學(xué)出版社, 1997∶ 324-341.

[3]王濤, 趙謀明. 多糖的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2007, 23(1)∶103-106.

[4]魏傳晚, 曾和平, 王曉娟, 等. 多糖及其研究進(jìn)展簡述[J]. 廣東化工,2004(1)∶ 36-40.

[5]趙國華, 陳宗道, 李志孝, 等. 活性多糖的研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2001, 27(7)∶ 45-48.

[6]邢書涵, 連正興, 孫勇藏, 等. 靈菇源干酪乳桿菌KL1胞外多糖抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(7)∶ 284-288.

[7]王肇穎, 肖敏. 白酒酒糟的綜合利用及其發(fā)展前景[J]. 釀酒科技,2004(1)∶ 65-69.

[8]劉丹. 對多糖測定方法的探討[J]. 四川文理學(xué)院學(xué)報∶ 自然科學(xué)版,2008, 18(2)∶ 49-51.

[9]武平, 趙文婧, 徐曉嬌, 等. 測定葡萄酒中總糖方法的探討[J]. 中國釀造, 2011, 227(1)∶ 158-161.

[10]趙凱, 許鵬舉, 谷廣燁. 3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(8)∶ 534-536.

[11]孫延芳, 梁宗鎖, 張欣, 等. 芒果多糖的純化與光譜分析[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(7)∶ 93-95.

[12]邸明磊, 單曉菊, 馬麗娜, 等. 苯酚-硫酸法測定苦豆子多糖含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐, 2012, 26(1)∶ 59-61.

[13]鐘巖, 潘浦群, 王艷紅. 苯酚-硫酸法測定鮮人參中多糖含量[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2008, 19(8)∶ 1957-1958.

[14]夏秀華, 王海鷗. 銀杏葉多糖兩種測定方法的比較[J]. 食品研究與開發(fā), 2007, 28(11)∶ 124-127.

[15]吳擁軍, 劉潔, 吳予明, 等. 中藥巴戟天多糖的測定及其微量元素分析[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2005, 25(12)∶ 2076-2078.

[16]劉曉涵, 陳永剛, 林勵, 等. 蒽酮硫酸法與苯酚硫酸法測定枸杞子中多糖含量的比較[J]. 食品科技, 2009, 34(9)∶ 270-272.

[17]吳亞軍, 朱穎, 夏少秋, 等. 蒽酮-硫酸法測定六味地黃生物制劑中多糖含量的研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2011, 22(1)∶ 39-41.

[18]鄭敏燕, 耿薇, 魏永生, 等. 萘酚-硫酸顯色光度法測定白果多糖含量方法的研究[J]. 應(yīng)用化工, 2010, 39(3)∶ 447-452.

[19]張世仙, 張素英, 曾啟華, 等. 堿法提取茅臺酒糟中水溶性膳食纖維的工藝研究[J]. 中國釀造, 2011, 30(10)∶ 126-128.

[20]張世仙, 從凱龍, 曾啟華, 等. 酶法提取茅臺酒糟中水溶性膳食纖維的工藝研究[J]. 中國釀造, 2012, 31(3)∶ 97-99.

[21]張桂香, 王元秀, 宋曉妍, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化啤酒酵母泥中β-1,3-葡聚糖提取工藝[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(6)∶ 92-95.

[22]毛磊, 李睿, 金慧芳. 酶解輔助法優(yōu)選山藥多糖的提取工藝[J]. 應(yīng)用化工, 2009, 38(6)∶ 847-849.