顧賽麒，王錫昌，陶寧萍*，張晶晶

(上海海洋大學食品學院，上海 201306)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗名大閘蟹，又稱河蟹、毛蟹，地域上北起遼河而南至珠江，在各地通海河流及湖泊均有分布，具有較高經(jīng)濟價值。2010年全國產(chǎn)量為59.33萬t，產(chǎn)值突破300億元[1]。中華絨螯蟹因其生長環(huán)境的不同，可進一步區(qū)分為“湖蟹”、“江蟹”、“塘蟹”等，文獻[2]報道中華絨螯蟹會因其生長地域的不同而導致其風味成分存在一定差異性[2]。上海市松江地區(qū)歷來均有養(yǎng)殖中華絨螯蟹的傳統(tǒng)，其出產(chǎn)的中華絨螯蟹曾多次參加國內(nèi)舉辦的河蟹評比大賽，深受專家及廣大消費者好評，但目前國內(nèi)尚無對其風味成分的報道。

風味物質(zhì)是指一類能為人體感覺器官所感知的水溶性或揮發(fā)性的低分子質(zhì)量化合物。前者一般稱為呈味物質(zhì)，種類相對固定，可刺激人味蕾細胞產(chǎn)生酸、甜、苦、咸、鮮等感覺，目前對其研究較為透徹；而后者又可稱為香氣物質(zhì)，通常需在一定條件下(如加熱、酶催化等)由風味前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來。風味前體物質(zhì)指經(jīng)熱加工后可轉(zhuǎn)化成香氣物質(zhì)的組分，一般由兩大類構(gòu)成：水溶性成分(氨基酸、肽類、碳水化合物、核苷酸、硫胺素等)和脂溶性成分(脂質(zhì)等)。風味前體物質(zhì)的復雜性與交互反應性，決定了香氣物質(zhì)的極端多樣性，目前在水產(chǎn)品中經(jīng)鑒定得到的香氣物質(zhì)已達上千種之多。

不同的香氣物質(zhì)通常具有不同的感官特性，多種香氣物質(zhì)共同作用構(gòu)成了中華絨螯蟹的整體風味輪廓，并顯著影響其綜合感官品質(zhì)。此外，消費者在品嘗蟹樣前首先嗅聞其香氣，香氣物質(zhì)的可接受性將直接影響消費者對蟹樣的喜好程度。同時，消費者咀嚼樣品時，口腔內(nèi)部溫度對破碎后的肉樣可起到類似“加熱”的效果，有利于其內(nèi)部的香氣物質(zhì)充分揮發(fā)并再次進入鼻腔形成“鼻后香”，使消費者對蟹樣香氣的感知更為全面。

自20世紀90年代以來，國外學者對藍蟹、雪蟹等海水蟹類的揮發(fā)性風味成分做了一定的研究報道[3-18]，鑒定得到了一些香氣物質(zhì)，但研究時主要采取的是同時蒸餾萃取法(simultaneous distillation-extraction，SDE)。SDE法由于提取溫度較高、提取時間長、提取過程中容易造成某些易揮發(fā)性風味成分的流失從而造成蟹類整體風味成分的變化[19]。近年來，針對于有復雜介質(zhì)或含協(xié)同效應揮發(fā)性成分的樣品而建立起來的氣味指紋技術(shù)也已運用于水產(chǎn)品風味方面的檢測，其中電子鼻(electronic nose)作為一種集分析、識別、檢測復雜揮發(fā)性成分功能于一體的新型儀器，具有客觀、準確、重復性好及無損等優(yōu)點，而頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法(headspace solid phase micro-extraction coupled with gas chromatography and mass spectrometry，HS-SPME-GCMS)則能夠?qū)]發(fā)物進行精確定性、定量，故而越來越受到人們的重視[20-21]，故本實驗采取上述兩種方法對松江出產(chǎn)的中華絨螯蟹不同可食部位中的香氣成分進行研究，期望可為構(gòu)建完整的中華絨螯蟹風味物質(zhì)庫提供相關(guān)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中華絨螯蟹：2011年10月下旬，從上海市松江區(qū)魚躍公司養(yǎng)殖基地采集二級雌性大閘蟹20只?；钚凡稉瞥鏊罅⒓从寐槔K扎緊(防止其劇烈掙扎造成營養(yǎng)物消耗)，放置入底部鋪冰的泡沫箱內(nèi)迅速帶回實驗室。

Fox 4000 Sensory Array Fingerprint Analyze電子鼻法國Alpha MOS公司；6890-5975B氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent質(zhì)譜公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責任公司；手動進樣手柄、萃取頭(碳分子篩(CAR)/二甲基硅氧烷(PDMS)，涂層厚度75μm)美國Supelco公司；15mL棕色頂空萃取瓶 上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 樣品前處理方法

將捆扎好的中華絨螯蟹從泡沫塑料箱中取出，以自來水沖洗去表面的泥沙等雜質(zhì)，用毛巾擦拭干凈，依次放入不銹鋼蒸鍋內(nèi)蒸制30min。取出蒸熟蟹樣，冷卻至室溫，打開頭胸甲，手工剝離性腺；剪開蟹螯，刮取鉗肉；剪開步足，刮取足肉；剪開頭胸甲底部內(nèi)骨骼，刮取體肉；將體肉、鉗肉、足肉、性腺樣品收集至同一個食品級密實袋中并做標記。待4部位樣品收集完畢后，用經(jīng)消毒程序處理(刀口經(jīng)火焰灼燒10s后再紫外輻照30min)的絞肉機將每一密實袋中的體肉、鉗肉、足肉、性腺充分絞碎至均勻，精確稱取每份質(zhì)量為(2.00±0.01)g和(6.00±0.01)g的絞碎后肉樣，分別裝入5mL電子鼻進樣瓶和15mL棕色頂空瓶中備用。

1.3 電子鼻檢測

將電子鼻進樣瓶于50℃平衡10min后，以潔凈干燥空氣為載氣，流速150mL/min，進樣體積2500mL，1s進樣完畢，注射針溫度60℃，數(shù)據(jù)采集時間120s，延滯時間10min。

1.4 GC-MS檢測

1.4.1 頂空固相微萃取

將內(nèi)裝樣品的頂空瓶置于室溫條件下平衡10min后，以SPME針管插入頂空瓶的硅橡膠瓶墊，伸出75μm CAR/PDMS萃取頭，在沸水浴條件下吸附50min。待吸附完畢，取出插入GC-MS進樣口，240℃解吸5min，熱脫附進行GC-MS 檢測。

1.4.2 GC-MS條件

色譜柱：DB-5MS彈性毛細管柱(60m×0.32mm，1μm)；不分流模式，起始柱溫40℃，無保留，然后以5℃/min升至100℃，無保留；再以3℃/min升至180℃，無保留；接著以8℃/min升至240℃，保留5min。載氣為He，流量1.0mL/min；汽化室溫度240℃。質(zhì)譜條件：電子電離(electron ionization，EI)離子源；電子能量70eV，燈絲發(fā)射電流為200μA，離子源溫度為200℃，檢測器電壓1.2kV。

1.4.3 揮發(fā)物的定性及定量方法

定性方法[6]：1)將揮發(fā)物質(zhì)譜圖與NIST和Wiley(2008)標準譜庫進行匹配，僅報道正、反匹配度大于800(最大值為1000)的鑒定結(jié)果。2)根據(jù)揮發(fā)物的保留時間計算保留指數(shù)(RI)，計算公式如式(1)：

式中：tR(x)、tR(n)、tR(n＋1)分別為待測揮發(fā)物、含n及n＋1個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時間，將計算得RI值與文獻報道的進行比對。

定量方法[22]：將2μL原始含量為1000mg/g的內(nèi)標物2,4,6-三甲基吡啶(2,4,6-trimethyl pyridine，TMP)加入6g中華絨螯蟹樣品中，通過計算待測揮發(fā)物與TMP的峰面積之比求得其含量(假定各揮發(fā)物的絕對校正因子為1.0)，計算公式如式(2)：

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

電子鼻數(shù)據(jù)的PCA分析由儀器自帶的AlphaSoft V 12.0軟件處理，GC-MS數(shù)據(jù)的PCA和CA分析由SPSS 19.0完成，香氣物質(zhì)差異顯著性分析由法單因素方差分析(One-Way ANOVA)中的LSD法完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻結(jié)果分析

圖1 中華絨螯蟹體肉、鉗肉、足肉及性腺電子鼻數(shù)據(jù)PCA分析圖Fig.1 Principal component analysis chart for E-Nose data of abdomen,claw and leg meats and spawn in Eriocheir sinensis

由圖1可見，第1主成分PC1與第2主成分PC2貢獻度之和均在95%以上。表明不同部位的中華絨螯蟹蟹肉、性腺香氣成分差異明顯，而此差異能在PC1、PC2構(gòu)建的平面上充分展示。圖1顯示電子鼻區(qū)分指數(shù)為81，區(qū)分指數(shù)(discrimination index，DI)最大值為100，其值越大表明不同組數(shù)據(jù)之間區(qū)分度越好，一般≥80表示能夠有效區(qū)分。本圖中DI值為81，表明不同部位的中華絨螯蟹蟹肉、性腺電子鼻數(shù)據(jù)組之間無重疊，區(qū)分度較好。

進一步分析圖1可見，雌性中華絨螯蟹不同部位的電子鼻數(shù)據(jù)點均能較好區(qū)分開，且其分布存在一定規(guī)律性：性腺的香氣較為特殊，其數(shù)據(jù)點與3種蟹肉數(shù)據(jù)點距離較遠，且差異主要體現(xiàn)在第1主成分軸上(PC1貢獻率達87.12%)。相對而言，體肉、鉗肉和足肉的數(shù)據(jù)點相對集中，其差異性主要體現(xiàn)在第2主成分軸上(PC2貢獻率較小，僅為9.15%)，表明其整體香氣輪廓較為相似。

2.2 GC-MS結(jié)果分析

2.2.1 中華絨螯蟹不同部位中香氣物質(zhì)鑒定

運用HS-SPME-GC-MS法對采自松江的二級雌性中華絨螯蟹體肉、鉗肉、足肉及性腺中的香氣物質(zhì)進行檢測，所得結(jié)果見表1。本實驗共鑒定得到48種化合物：醛類21種、酮類5種、醇類3種、芳香類4種、呋喃類5種、含氮類2種、烴類8種。中華絨螯蟹體肉、鉗肉、足肉和性腺中分別檢測到28、32、33、38種香氣物質(zhì)，其中有24種物質(zhì)在4個部位中同時出現(xiàn)(以*標注)。48種香氣物質(zhì)除乙醛等7種外，其余41種在研究蟹類風味的外文文獻中均有報道。此外，由表1可知，體肉、鉗肉、足肉和性腺中香氣物質(zhì)的濃度值總和呈遞增趨勢，并均具有顯著性差異(P＜0.05)。

然而，香氣物質(zhì)濃度值高低并不能直接反映消費者對其的“感受強度”，還必須考慮閾值的影響，通常把人能感受到某種香氣物質(zhì)的最低濃度稱為“閾值(threshold)”。濃度一定時，閾值越低的化合物越容易被感知；閾值一定時，濃度越高的化合物越容易被感知。由此，消費者對各香氣物質(zhì)的“感受強度”最終可通過該化合物的濃度值除以閾值得到，將此比值命名為“活性值(odor activity value，OAV)”，OAV具體含義為某香氣物質(zhì)濃度超過自身閾值的倍數(shù)，OAV＞1時可認為此香氣物活性較高，可進一步定義為“活性香氣物質(zhì)”。

2.2.2 中華絨螯蟹不同部位中活性香氣物質(zhì)分析

表2展示了中華絨螯蟹體肉、鉗肉、足肉和性腺中的活性香氣物質(zhì)。癸醛等12種化合物為4部位所共有，且OAV均大于1(在閾值之上)，可認為其對中華絨螯蟹整體香氣輪廓貢獻顯著。進一步分析表2可知，此12種物質(zhì)中有9種是C5～C10的飽和及不飽和醛類，醛類一般是脂質(zhì)的熱降解產(chǎn)物，而烯醛和二烯醛則來源于亞油酸酯和亞麻酸酯的氫過氧化物的降解，通常具有青香、果香、堅果香和奶酪香等香氣[23]。3～4個碳原子的醛具有強烈的刺激性風味，5～9個碳原子的醛具有清香、油香、脂香風味，碳鏈更長的醛類雖表面上沒有可檢測到的芳香，但其可作為其他重要芳香化合物的前體(如雜環(huán)化合物)。飽和的直鏈醛常有令人不快的、辛辣的、尖刺的和刺激性的氣味并帶有油的和蠟的特征氣味。多不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)生各種醛(如辛醛和壬二烯醛)，是肉制品中構(gòu)成各種氧化風味的重要來源[24]。苯甲醛是由氨基酸的斯特克雷爾氨基酸反應生成的，已被鑒定為烤花生仁的主要單羰基化合物，被感覺有令人愉快的杏仁香、堅果香和水果香，是存在于小龍蝦尾肉和蟹肉中的一種重要風味揮發(fā)物，而3-甲基丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛等作為低閾值醛類，據(jù)報道[24]此類醛類即便在痕量條件下，也有一種很強的與許多其他風味物質(zhì)重疊的風味效應，對構(gòu)成蟹肉香味具有重要貢獻。

表1 中華絨螯蟹體肉、鉗肉、足肉及性腺中的香氣物質(zhì)Table 1 Aroma compounds identified in abdomen, claw and leg meats and spawn of Eriocheir sinensis

表2 中華絨螯蟹體肉、鉗肉、足肉和性腺中活性香氣物質(zhì)(OAV＞11))Table 2 Aroma-active compounds in abdomen, claw and leg meats and spawn of Eriocheir sinennssiis s (OAV ＞ 11))

同時，對于上述12種活性香氣物質(zhì)，其感官特征在文獻中被描述為：油脂味、魚腥味、青草味、奶油味及燒烤味等，此結(jié)果與陳德慰[23]對中華絨螯蟹所做的感官評定結(jié)果較為一致，表明本實驗結(jié)果可信度較高。此外，除癸醛等12種物質(zhì)外，2,4-癸二烯醛(E,E)、三甲胺、2,6-壬二烯醛、2-甲基丁醛此4種化合物雖不為中華絨螯蟹4部位所共有，但其OAV在某一部位中處于優(yōu)勢地位(排名前10)，故在表2中也將其展示。

2.2.3 特征性活性香氣物質(zhì)分析

圖2 主成分載荷圖Fig.2 Biplot of principal component analysis (PCA)

圖中“樣品點”和“箭頭”分別代表中華絨螯蟹4部位的“總體香氣輪廓”及“每一香氣變量”在第1、第2主成分上的投影(“樣品點”參照主級橫縱坐標軸，位于圖內(nèi)部，量程為[-4.0,4.0]，括號內(nèi)數(shù)字代表得分排名；“箭頭”參照次級橫縱坐標軸，位于圖外部，量程為[-1,1])。“箭頭”與原點距離代表其被第1、第2主成分解釋的程度；“樣品點”與“箭頭”在主成分空間中越接近，則表示兩者的相關(guān)程度越高(首先看是否處于同一象限，其次看兩者在同一象限中與坐標軸的夾角是否接近)，由此可判斷中華絨螯蟹不同部位的特征香氣成分[25-28]。

由圖2可見，性腺樣品點位于右下區(qū)域(第4象限)，2-乙基呋喃(F2)、己醛(Q7)、壬醛(Q15)3種活性香氣物質(zhì)與其相關(guān)性顯著；鉗肉和足肉樣品點位于左上區(qū)域(第2象限)，前者與檸檬烯(H2)關(guān)聯(lián)密切，后者與癸醛(Q18)相關(guān)性較高；體肉樣品點位于左下區(qū)域(第3象限)，沒有與其相關(guān)的活性香氣物質(zhì)，分析原因可能是體肉中這12種活性香氣物質(zhì)的OAV相對較小。3-甲基丁醛(Q2)、4-庚烯醛(Q9)、庚醛(Q10)、苯甲醛(Q11)、辛醛(Q12)、癸醛(Q18)和2-戊基呋喃(F4)7種活性香氣物質(zhì)位于第1象限，沒有與之相對應的樣品點，分析原因可能是此7種物質(zhì)OAV并無在某一部位中特別突出。綜合上述分析結(jié)果，可得到5種表征中華絨螯蟹風味特性的特征性活性香氣物質(zhì)。

圖1、2分別展示了電子鼻和GC-MS的主成分分析結(jié)果。這兩種儀器均能用于水產(chǎn)品香氣成分的分析，前者擅長對樣品整體香氣輪廓進行區(qū)分，而后者可以檢測樣品中所含的具體香氣組分。由圖1、2可見，電子鼻和GC-MS的主成分分析結(jié)果較為一致：3種蟹肉(體肉、鉗肉和足肉)的香氣輪廓較為接近，而性腺的香氣輪廓較為特殊。此外，圖1、2結(jié)果也有存在一定差異性：圖2中體肉樣品點距離鉗肉和足肉較遠，而在圖1中3者彼此接近，究其原因可能是電子鼻和GC-MS的工作原理及儀器靈敏度存在差異。

采用SPSS 19.0軟件，以“類間平均距離法”作為測量方法，以“夾角余弦”作為評價指標，對表1中篩選得到的12種活性香氣物質(zhì)的OAV數(shù)據(jù)進行聚類分析[29]，結(jié)果見圖3。圖3中“0～25”的標度是將檢測對象的評價指標按統(tǒng)一尺度映射后的結(jié)果?？芍敇硕葹?0時，可將12種活性香氣物質(zhì)聚為3類：檸檬烯(H2)為一類，2-乙基呋喃(F2)、己醛(Q7)、壬醛(Q15)和戊醛(Q4)為一類，剩余7種活性香氣物質(zhì)為一類。將圖3聚類分析的結(jié)果與圖2主成分分析的結(jié)果進行對比后可發(fā)現(xiàn)：聚得的3類香氣成分中，每一類中均獨立含有(不同時兼有)代表某一可食部位的特征性活性香氣物質(zhì)，表明兩種分析方法可相互印證、互為補充。

圖3 中華絨螯蟹活性香氣物質(zhì)聚類分析圖Fig.3 Plot of cluster analysis (CA) of aroma-active compounds

3 討論與結(jié)論

本實驗運用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用及電子鼻技術(shù)檢測了采自松江的二級雌性中華絨螯蟹體肉、鉗肉、足肉和性腺的香氣成分。電子鼻結(jié)果顯示，中華絨螯蟹不同部位香氣輪廓存在一定差異性，可進行明顯區(qū)分。采用GC-MS從中華絨螯蟹4個可食部位中共檢測到7大類48種香氣物質(zhì)。通過查找各香氣物閾值并計算其活性值，確定了其中對中華絨螯蟹各部位整體香氣輪廓貢獻顯著的12種活性香氣物質(zhì)(OAV＞1)，多為飽和及不飽和醛類，且均獲多篇外文文獻證實。

對中華絨螯蟹體肉、鉗肉、足肉和性腺中的12種活性香氣物質(zhì)的OAV進行主成分分析和聚類分析，由主成分分析得到：2-乙基呋喃(F2)、己醛(Q7)、壬醛(Q15)為表征中華絨螯蟹性腺的特征性活性香氣物質(zhì)；檸檬烯(H2)和癸醛(Q18)分別是表征鉗肉及足肉的特征性活性香氣物質(zhì)。由聚類分析得到：12種活性香氣物質(zhì)可聚為3類，且每類都獨立含有代表某一特定部位的特征性香氣物質(zhì)。

本研究針對非陽澄湖出產(chǎn)的、品質(zhì)同樣出眾的松江中華絨螯蟹4個可食部位中所含的香氣成分進行了較為全面的分析，提出了一種結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法鑒定水產(chǎn)品特征性活性風味物質(zhì)的新思路，為今后成功構(gòu)建完整的中華絨螯蟹“風味物質(zhì)庫”提供了相關(guān)實驗依據(jù)。

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