吳肖仙 馮淦清

影響ELISA檢測(cè)HBsAg結(jié)果的常見(jiàn)因素

吳肖仙 馮淦清

目的分析酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）對(duì)表面抗原影響的常見(jiàn)因素，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。方法使用ELISA法檢測(cè)HBsAg，對(duì)檢測(cè)步驟進(jìn)行分析總結(jié)，分析可能存在影響檢測(cè)質(zhì)量的因素和質(zhì)控方法。結(jié)果血清標(biāo)本、試劑盒、操作過(guò)程、結(jié)果數(shù)據(jù)分析等因素是影響ELISA檢測(cè)HBsAg結(jié)果的主要因素，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制可以提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。結(jié)論ELISA方法檢測(cè)HBsAg影響因素較多，對(duì)于HBsAg陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)重視復(fù)查，以確保檢驗(yàn)結(jié)果的客觀性。

乙肝表面抗原；ELISA方法；影響因素；準(zhǔn)確度

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記[1]。ELISA方法操作簡(jiǎn)單、過(guò)程簡(jiǎn)便，已成為檢測(cè)乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的臨床常用手段，但在實(shí)際工作中該方法易存在多個(gè)影響結(jié)果準(zhǔn)確性的因素，筆者分析ELISA影響HBsAg檢測(cè)的常見(jiàn)因素，具體情況匯報(bào)如下。

1 血清標(biāo)本

檢驗(yàn)科技術(shù)人員在標(biāo)本檢測(cè)前應(yīng)先觀察血液樣本，部分不符合測(cè)試要求的血液樣本應(yīng)重新抽取，如乳糜血、嚴(yán)重黃疸等樣本可能因?yàn)檠屦こ矶雀?，使抗原反?yīng)在一定程度上受到屏蔽，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。杜絕血液的生理特性，室溫下第9天，4～8℃第14天后血液標(biāo)本將出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，具有酶活性的血紅蛋白大量出現(xiàn)，導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。相同原理，溶血標(biāo)本應(yīng)重新抽取。血液抽取后，待血液充分凝固后應(yīng)及時(shí)分離血清，如分離不完全，血清標(biāo)本中參雜纖維蛋白，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。故筆者認(rèn)為血液標(biāo)本應(yīng)及時(shí)充分分離，及時(shí)檢測(cè)，如若條件不足未能及時(shí)檢測(cè)，則應(yīng)當(dāng)將標(biāo)本充分分離后置于低溫冰箱中。血清標(biāo)本禁反復(fù)凍溶。

2 試劑

不同生物試劑公司的ELISA試劑盒存在敏感度、特異性的差別，檢驗(yàn)設(shè)備亦要求配套的試劑盒參數(shù)，以保證檢測(cè)質(zhì)量。試劑盒購(gòu)買(mǎi)后應(yīng)置于4℃～6℃環(huán)境，每批次新進(jìn)試劑應(yīng)在使用前作質(zhì)量控制，如空白試驗(yàn)、陰陽(yáng)性對(duì)照、臨界陽(yáng)性標(biāo)本檢驗(yàn)等。在檢測(cè)前要室溫中平衡20min后再行測(cè)定，該步驟可使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度迅速達(dá)到所需溫度，利于后續(xù)測(cè)定。剩余的試劑應(yīng)繼續(xù)保存于4℃～6℃環(huán)境，下次檢測(cè)前應(yīng)仔細(xì)檢查試劑是否變質(zhì)，過(guò)期產(chǎn)品不予繼續(xù)使用。

3 操作因素

ELISA操作過(guò)程包括加樣、孵育、洗板、顯色四個(gè)主要步驟。ELISA試劑盒在室溫下平衡溫度20min后，操作者將事先校準(zhǔn)的移液槍進(jìn)行手工加樣，加樣量應(yīng)盡量準(zhǔn)確均一，加樣過(guò)程中移液器應(yīng)垂直使用，不接觸包被板底部，使檢測(cè)樣品均處于加樣板的包被區(qū)域，操作過(guò)程中不允許樣品濺出或有氣泡產(chǎn)生。如果使用自動(dòng)加樣儀進(jìn)行上樣，為了保證足夠的加樣量，應(yīng)選用帶有指示劑稀釋試劑作為樣品加注與否的監(jiān)測(cè)指示。儀器責(zé)任人應(yīng)當(dāng)定期校準(zhǔn)儀器，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的準(zhǔn)確度。

加樣結(jié)束后進(jìn)行樣本孵育，孵育時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有重要影響，根據(jù)生理特性，HBsAg孵育溫度為37℃，孵育時(shí)間根據(jù)不同試劑盒有不同的要求，操作應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為了最大程度降低實(shí)驗(yàn)的邊緣效應(yīng)，HBsAg孵育應(yīng)采取水浴，并將96孔板用封膜緊密封閉，避免其他污染物對(duì)樣本造成污染而影響結(jié)果。使用的恒溫水浴箱溫度準(zhǔn)確、恒定，每天記錄溫度，放樣本孵育前應(yīng)先觀察溫度。

孵育完成后對(duì)測(cè)試孔板進(jìn)行洗滌，采用新鮮配制的洗滌液，其配制過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。洗滌液清洗測(cè)試板過(guò)程中分離結(jié)合與未結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物及酶標(biāo)記物，將孔板內(nèi)非特異性吸附的蛋白質(zhì)、血球中酶成分徹底清除，減少干擾，鑒于血清中殘留的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，故筆者建議每日清洗洗板機(jī)以確保結(jié)果準(zhǔn)確性，且每次洗板次數(shù)不低于6次。

洗板完成后進(jìn)行顯色操作，使用試劑盒配套的顯色液進(jìn)行顯色，顯色終止15min內(nèi)酶標(biāo)儀讀數(shù)，酶標(biāo)儀應(yīng)避光操作，且操作前應(yīng)事先預(yù)熱10min。

4 數(shù)據(jù)分析

抗原抗體特異性反應(yīng)時(shí)，生成結(jié)合物的量與反應(yīng)物的濃度有關(guān)。無(wú)論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均可發(fā)現(xiàn)只有在兩者分子比例合適時(shí)才出現(xiàn)最強(qiáng)的抗原-抗體反應(yīng)；由于抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象叫鉤狀效應(yīng)。ELISA測(cè)試過(guò)程中由于血清中HBsAg濃度過(guò)高、血液黏稠度高、血脂高等容易出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)而影響結(jié)果，故應(yīng)將檢測(cè)結(jié)果同臨床診斷相結(jié)合，做出數(shù)據(jù)的最后判讀。

5 討論

ELISA其操作原理是根據(jù)結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析，以了解被測(cè)標(biāo)本中抗體或抗原含量[2-3]。

ELISA方法因操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉而被廣泛運(yùn)用，但其加樣、溫度、孵育時(shí)間、洗板、顯色等因素的影響，導(dǎo)致有一定的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，給臨床結(jié)果判讀帶來(lái)一定程度的影響。本文通過(guò)對(duì)ELISA影響因素分析和總結(jié)，針對(duì)性進(jìn)行質(zhì)量控制，減少或避免人為因素影響，提高結(jié)果準(zhǔn)確性；對(duì)于HBsAg陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)重視復(fù)查，以確保檢驗(yàn)結(jié)果的客觀性。

[1] 葉千紅,張麗霞.關(guān)于標(biāo)本因素對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果影響的分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2003,7(5)：440-441.

[2] 張蕾,周晶珠,王立.乙型肝炎分子生物學(xué)檢驗(yàn)方法的應(yīng)用及質(zhì)量控制[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2009,47(14)：98-99.

[3] 杜艷霞.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定操作的體會(huì)[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2009,4(27)：139-140.

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1673-5846(2013)01-0331-02

東莞市橋頭醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523520