胡楠楠， 王雪峰， 王子， 岳志軍， 南春紅， 朱萬青， 暴春曉

流感病毒（influenza virus）屬于正黏病毒科成員，為單分子負鏈RNA病毒，能引起上下呼吸道疾病，中藥在抗病毒方面有其獨特的優(yōu)勢，特別是不易造成耐藥性的優(yōu)點，而在抗病毒研究和應(yīng)用中備受關(guān)注。

自清初“溫病學(xué)說”興起，中醫(yī)藥對類流感樣溫病初期的治療更上一個新的臺階，吳鞠通提出“治上焦如羽，非輕不舉”創(chuàng)“銀翹散”方沿用至今。在當今抗生素耐受、病毒變異等的現(xiàn)狀下，中醫(yī)藥對于外感熱病，在“扶正祛邪”總原則指導(dǎo)下彰顯新的特點：一是在治療用藥上，從抗病原微生物作用的深入探討“祛邪”治則，提出傳統(tǒng)“肺毒熱”理論［1］，循先證而治以“截斷扭轉(zhuǎn)”并且“清熱解毒”貫穿始終；二是重視“扶正”，外邪入侵“首犯肺衛(wèi)”，并且重視地域、節(jié)氣的差別，“未病先防，已病防變”，在外感熱病中適時應(yīng)用清熱解毒辛涼解表法和補肺實衛(wèi)益氣固表法之“雙表法”相結(jié)合，清熱解毒辛涼解表法代表方劑為銀翹散，補肺實衛(wèi)益氣固表代表方劑為玉屏風(fēng)散，臨床起效頗佳［2］。

1 實驗材料

1.1 藥物

1.1.1 銀翹散精簡方提取物制備 銀翹散精簡方由金銀花、連翹、牛蒡子、荊芥穗、薄荷（9∶9∶9∶5∶6）5味藥組成，中藥材均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。金銀花、連翹、牛蒡子各9 g，荊芥穗5 g，薄荷6 g。采用70%乙醇為提取溶媒，8倍乙醇，經(jīng)熱回流提取2次，每次120 min。出膏率為14.44%。抽醇后，干燥粉末備用。

1.1.2 玉屏風(fēng)散提取物制備 玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)（3∶3∶1）3味中藥組成，黃芪、白術(shù)各30 g，防風(fēng)10 g，中藥材均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。采用70%乙醇為提取溶媒，10倍乙醇，經(jīng)熱回流提取2次，每次120 min。出膏率為25.16%。抽醇后，干燥粉末備用。

1.1.3 各中藥提取物供試液配制 銀翹散精簡方提取物供試液配制：38／60×12.33×小鼠體質(zhì)量（g）／1 000×出膏率（14.44%）；玉屏風(fēng)散提取物供試液配制：70／60×12.33×小鼠體質(zhì)量（g）／1 000×出膏率（25.16%）。將各組中藥提取物用生理鹽水配制成供試液，濃度為銀翹散提取物78.3 g／L、玉屏風(fēng)散提取物36.2 g／L，溶液進行藥物2倍稀釋。

1.1.4 陽性對照藥物 利巴韋林注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，批號：0903251），生理鹽水配制成200、100 g／L溶液備用。

1.2 病毒株、雞胚 甲型流感病毒甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株 A／FM1／47（H1N1），中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院病毒研究所提供。在無特定病原體雞胚（9日齡，SPF級，購買于遼寧益康生物有限公司）中培養(yǎng)傳代恢復(fù)毒力。

1.3 主要儀器與試劑 70%乙醇、生理鹽水、利巴韋林注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，批號：0903251），生理鹽水配制成100 g／L溶液備用等。生物安全柜（100%外排）（美國Baker公司，型號：SG403TXCE）；低溫高速離心機（德國 Heraeus，型號：BIOFUGE28RS）；臺式壓力蒸汽滅菌器（沈陽盛達生物電子設(shè)備有限公司，型號：DYMⅡ－JB20L）；AR2140電子分析天平（上海奧豪斯公司，型號：AE200）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠，型號：HH.B11.420）；純水機（法國 ELIX－S，型號：ZLXS5005Y）。

1.4 實驗方法

與新教思想一樣，儒家和陸九淵心學(xué)的世俗化主張并不是主張追求世俗享樂，而是主張在真實的日常世俗生活中追求成圣成賢，用更知名的話來說就是追求修身、齊家、治國、平天下。這種儒家的乃至陸九淵心學(xué)的世俗生活道德化的思想，與作為社會工作增能理論的思想基礎(chǔ)的新教思想是有著相同之處的。

1.4.1 甲型（H1N1）流感病毒鼠肺適應(yīng)株 A／FM1／47EID50的測定 將IV原液進行對數(shù)稀釋9個濃度（10－9～10－1），接種于9日齡雞胚，每個稀釋度接種6枚雞胚，每胚接種0.1 m L，另設(shè)3個雞胚為生理鹽水對照組，每個稀釋濃度接種6個雞胚，將雞胚置于35℃恒溫箱中孵育，經(jīng)10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續(xù)觀察3 d，并作觀察記錄。

1.4.2 中藥提取物對雞胚的最大無毒濃度的測定（TD0） 將3種提取物分別用滅菌生理鹽水作連續(xù)2倍比稀釋：21、原濃度、2－1、2－2、2－3，將這5個稀釋度的稀釋液分別接種于9日齡雞胚尿囊腔，每個稀釋度接種6胚，每胚接種0.2 m L，另設(shè)3枚雞胚為空白對照組。將雞胚置于35℃恒溫箱中孵育，連續(xù)觀察雞胚生長發(fā)育情況。以雞胚可存活96 h的最大濃度作為藥物的最大無毒劑量。

1.4.3 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感病毒FM1株毒力阻斷作用 先將最大無毒濃度的各組中藥提取物供試液接種于9日齡雞胚，將雞胚置于35℃恒溫箱中保溫，4 h后取出，再將含有100×EID50的病毒液按每枚0.1 m L接種于雞胚。每組中藥提取物接種6枚雞胚。另設(shè)利巴韋林組（100 g／L，6枚雞胚）、病毒對照組（6枚雞胚）、正常對照組（生理鹽水）（3枚雞胚）。將雞胚置于35℃恒溫箱中孵育，經(jīng)10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續(xù)觀察3 d，并作觀察記錄。

1.4.4 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感病毒毒力抑制作用 先將含有100×EID50的病毒液接種于9日齡雞胚，將雞胚置于35℃恒溫箱中保溫，4 h后取出，再將最大無毒濃度的各組中藥提取物供試液接種于9日齡雞胚。每組中藥提取物接種6枚雞胚。另設(shè)利巴韋林組（100 g／L，6枚雞胚）、病毒對照組（6枚雞胚）、正常對照組（生理鹽水，3枚雞胚）。將雞胚置于35℃恒溫箱中孵育，經(jīng)10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續(xù)觀察3 d，并作觀察記錄。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進行分析，F(xiàn)isher精確概率檢驗法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

流感病毒雞胚半數(shù)感染量EID50為10－6。各組提取物接種尿囊液后，雜菌實驗結(jié)果均為陰性。

2.1 各組提取物對雞胚的最大無毒濃度的測定（TD0） 雞胚尿囊腔接種藥物后，每日觀察雞胚存活情況。銀翹散、玉屏風(fēng)散提取物各濃度組雞胚生長發(fā)育與正常對照組基本一致；利巴韋林組雞胚發(fā)育較小。觀察72 h，銀翹散精簡方提取物自濃度39.15 g／L以下均存活，玉屏風(fēng)散提取物自濃度36.2 g／L以下均存活，正常對照組與利巴韋林最高劑量組（200 g／L）、利巴韋林正常劑量組（100 g／L）雞胚均存活，但利巴韋林最高劑量組雞胚不能發(fā)育成雞雛。

銀翹散精簡方提取物自39.15 g／L，玉屏風(fēng)散提取物自36.2 g／L，未見雞胚死亡，并發(fā)育良好。所以可以認為銀翹散精簡方提取物對雞胚最大無毒濃度大于39.15 g／L，玉屏風(fēng)散供試液對雞胚最大無毒濃度大于為36.2 g／L，利巴韋林最大無毒劑量為100 g／L。因銀翹散（39.15 g／L）、玉屏風(fēng)散提取物（36.2 g／L）原液已達到最高濃縮濃度，故在計算TI時，以該最大無毒劑量代替半數(shù)中毒劑量，結(jié)果見表1。

表1 銀翹散、玉屏風(fēng)散提取物液及對雞胚最大無毒濃度的測定

2.2 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感病毒毒力阻斷作用 見表2。

表2 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感病毒FM1株毒力阻斷作用的測定

結(jié)果表明，玉屏風(fēng)散提取物 ED50：9.57 g／L，TI大于3.78，對甲型流感病毒FM1株的毒力阻斷作用在濃度為36.2 g／L時，優(yōu)于其他濃度；銀翹散精簡方提取物ED50：7.41 g／L，TI大于5.28，對甲型流感病毒FM1株的毒力阻斷作用在濃度為19.58 g／L時，優(yōu)于其他濃度；玉屏風(fēng)散提取物對雞胚死亡的阻斷優(yōu)于銀翹散精簡方提取物。

2.3 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感FM1株病毒毒力抑制作用 見表3。雜菌實驗結(jié)果均為陰性。

表3 中藥提取物在雞胚水平上對甲型流感FM1株病毒毒力抑制作用的測定

表3結(jié)果表明，銀翹散精簡方提取物ED50為9.91 g／L，TI大于3.95，對甲型流感病毒 FM1株的毒力抑制作用在濃度為39.15 g／L時，優(yōu)于其他濃度；玉屏風(fēng)散提取物ED50為10.38 g／L，TI大于3.3，對甲型流感病毒FM1株的毒力抑制作用在濃度為36.2 g／L和18.1 g／L時（兩者毒力抑制作用均等），優(yōu)于濃度9.05 g／L；銀翹散提取物對雞胚死亡的阻斷優(yōu)于玉屏風(fēng)提取物。

3 討論

流感病毒為呼吸道常見病毒，其囊膜上的血凝素與神經(jīng)氨酸酶抗原的變異頻率很高，一種形式為抗原性漂移，另一種形式為甲型流感病毒所特有的抗原性轉(zhuǎn)移，決定甲型流感病毒的治療需要依據(jù)每年的病毒分離鑒別抗原性轉(zhuǎn)移來進行疫苗的研制和藥物的選擇。當前FDA批準用于防治流感的藥物只有金剛烷胺和金剛乙胺［3，4］，但由于他們僅對甲型流感病毒有效，并很快產(chǎn)生耐藥株，而使其使用更加的嚴格導(dǎo)致應(yīng)用受限。利巴韋林作為廣譜抗病毒制劑，常用做抗呼吸道病毒研究的陽性對照，有文獻報道，疾病早期使用利巴韋林霧化方法治療流感兒童，可明顯改善患兒的發(fā)熱等癥狀［5］。從細胞水平測試利巴韋林對甲型H1N1流感病毒有明顯抑制作用［6］，所以選擇利巴韋林為陽性對照。

本課題組在前期研究中，對銀翹散精簡方和玉屏風(fēng)散提取優(yōu)化進行了大量的研究［7］，以“三水平四因素”為正交設(shè)計醇提，通過高效液相色譜法定量分析，設(shè)立優(yōu)化評價權(quán)重，得出結(jié)論70%乙醇溶媒，8倍溶媒（銀翹散精簡方），10倍溶媒（玉屏風(fēng)散），提取2次，每次120 min，本研究也沿用上述實驗研究結(jié)果。

中醫(yī)藥對于外感熱病有其獨特的優(yōu)勢，中醫(yī)認為外感熱病的發(fā)生和發(fā)展是正邪交蒸的過程，“祛邪扶正”為其基本的治療原則，根據(jù)中醫(yī)“審證求因”原則，在疾病病情轉(zhuǎn)變的過程中，原有癥狀的變化或新癥狀的出現(xiàn)，必定存在治療方法的變化，外感熱病初期使用辛涼解表藥物并在疾病過程中重用清熱解毒藥物（以銀翹散為代表方劑）［1］，當風(fēng)熱輕癥向重癥轉(zhuǎn)化過程中，在治療基礎(chǔ)上適當扶正加用補肺實衛(wèi)之品，防疾病轉(zhuǎn)變本臟重癥。對于某些患兒效果不理想，以及反復(fù)外感、病勢纏綿，對其治療配合使用補肺實衛(wèi)益氣固表，比如補肺實衛(wèi)益氣固表適時使用玉屏風(fēng)散等藥劑口服［8］，對已有的疾病防止其進一步發(fā)展和惡化，而在疾病好轉(zhuǎn)或治愈后還要積極防止其復(fù)發(fā)及可能帶來的后遺癥。

本研究也證明了上述觀點，在中藥提取物對甲型流感病毒FM1株毒力阻斷階段，玉屏風(fēng)散作用優(yōu)于銀翹散精簡方，而在其毒力一直階段，銀翹散精簡方更優(yōu)。兩種中藥提取物在病毒毒力阻斷、抑制作用和雞胚死亡阻斷的作用上更優(yōu)于利巴韋林對照，其在動物實驗階段的研究尚在研究中。

［1］ 王雪峰.從肺毒熱論治小兒肺炎本臟重癥［J］.中醫(yī)雜志，2012，53（3）：200－202.

［2］ 胡楠楠，王雪峰.從“雙表法”論治小兒肺系外感熱?。跩］.中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué)，2013，10（5）：413－414.

［3］ Cohen Stuart JW，Boucher CA，Cooper DA，et al.Summary of the III International Consensus Symposium on Combined Antiviral Therapy.［J］.Antiviral Res，1998，38 （2）：75－93.

［4］ Scholtissek C，Webster RG.Long－term stability of the anti－influenza A compounds－－amantadine and rimantadine［J］.Antiviral Res，1998，38（3）：213－215.

［5］ Rodriguez WJ，Hall CB，Welliver R，et al.Efficacy and safety of aerosolized ribavirin in young children hospitalized with influenza：a double－blind，multicenter，placebo－controlled trial［J］.J Pediatr，1994，125（1）：129－135.

［6］ 蔣虹，金光，叢喆，等.奧司他韋、利巴韋林和鹽酸金剛乙胺對甲型H1N1流感病毒的抑制作用［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011，21（2）：23－25.

［7］ 王文麗，王雪峰，郝歐美，等.銀翹散提取工藝及指紋圖譜初步研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，38（7）：174－176.

［8］ 任芳，李麗明.芪眾顆粒預(yù)防流行性感冒的實驗研究［J］.同濟大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，28（5）：40－42.