柳俊靈

（青島科技大學(xué),山東 青島 266042）

雙歧桿菌(Bifidobacterium)首次發(fā)現(xiàn)是由Henry Tissier于1899年從母乳喂養(yǎng)的嬰兒糞便中分離得到[1]。雙歧桿菌屬于革蘭氏陽性桿菌,對氧十分敏感，對低pH耐性差，極易失活，最適pH為6.5～7.0，最適生長溫度37～42℃[2]。雙歧桿菌能有效地維持腸道正常菌群平衡，同時對于抗腹瀉、抗便秘、抗感染、抗腫瘤等方面也有獨(dú)特的生理功能。雙歧桿菌在生長過程中產(chǎn)生的維生素、氨基酸類營養(yǎng)物質(zhì)能改善牛奶的營養(yǎng)價值，因此在牛奶生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[3]。但由于雙歧桿菌對生長環(huán)境要求嚴(yán)格，致使在生產(chǎn)中菌株培養(yǎng)較困難，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)品活菌數(shù)量少等問題。為解決這類問題，國內(nèi)外學(xué)者對雙歧桿菌培養(yǎng)條件和發(fā)酵工藝進(jìn)行了廣泛的研究報道。

1 培養(yǎng)基中各成分對雙歧桿菌發(fā)酵的影響

1.1 碳源

通常用葡萄糖等單糖和低聚糖作為雙歧桿菌生長的主要碳源。邵建寧等[4]通過改變碳源、pH和添加低聚糖研究其對長雙歧桿菌生長的影響，得到最佳培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)20h后，菌落數(shù)達(dá)8.9×109cfu/mL，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)時間縮短4h，活菌數(shù)提高8.1倍。鹿曉菲等[5]研究出適合工業(yè)生產(chǎn)的低成本培養(yǎng)基，以廢糖蜜、玉米漿代替培養(yǎng)基中的碳源、氮源，同時添加番茄汁、低聚果糖，經(jīng)培養(yǎng)32h后，活菌數(shù)可達(dá)4.33×109cfu/mL，有較高的工業(yè)應(yīng)用價值。

1.2 氮源

氮源主要是胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物等。種克等[6]對雙歧桿菌麥芽復(fù)合汁增菌培養(yǎng)基進(jìn)行研究，結(jié)果表明大豆蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米漿可顯著促進(jìn)兩岐雙歧桿菌增殖。酵母膏富含核苷酸、蛋白質(zhì)，對活菌數(shù)有明顯的影響，生產(chǎn)中缺少酵母膏菌體將停止生長。肖仔君等[7]報道了酵母膏對短雙歧桿菌有較為顯著的影響，在以TPY為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h后，菌數(shù)可達(dá)2.1×1010cfu/mL。王振國[8]對苦豆籽粕—雙歧桿菌合生元進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在培養(yǎng)基中添加6%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的苦豆籽粕對兩歧雙歧桿菌的體外生長有明顯的促進(jìn)作用，兩歧雙歧桿菌活菌數(shù)的數(shù)量級是對照組的1000倍。

1.3 生長因子對雙歧桿菌的促生長作用

生長因子對雙歧桿菌的增殖有顯著作用。增殖因子主要包括低聚糖類雙歧因子、蛋白質(zhì)水解形成的肽類、天然植物及中草藥提取物類等。

1.3.1 低聚糖類

低聚糖類是雙歧因子的主要組成部分，目前常見的低聚糖主要有低聚木糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖等20余種。項明潔[9]等研究了低聚果糖對雙歧桿菌增殖效果及腸道菌群的影響，研究結(jié)果表明在厭氧液體培養(yǎng)基加入低聚果糖后雙歧桿菌菌數(shù)由1.5×108cfu/mL增加到3×108cfu/mL。

1.3.2 蛋白質(zhì)水解肽類產(chǎn)物

蛋白質(zhì)水解肽類雙歧因子主要有乳清蛋白、乳鐵蛋白、酪蛋白水解物、胃粘膜蛋白水解物等。工業(yè)中常用的蛋白類雙歧因子中增殖效果最為明顯的是酵母浸提液，除此之外大豆胰蛋白酶水解物和牛肉浸膏在工業(yè)中應(yīng)用也較為廣泛。吳敏等[10]對影響嬰兒雙歧桿菌生長的雙歧因子進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示雙歧因子對其活化的影響程度依次為酵母浸提液、酪蛋白胨、磷酸氫二鉀。C.Janer[11]研究發(fā)現(xiàn)在牛乳培養(yǎng)基中添加2%酪蛋白時，雙歧桿菌活菌數(shù)比對照組提高1.51g，而在添加2%的乳清蛋白的牛乳培養(yǎng)基中，雙歧桿菌菌落數(shù)達(dá)到最高。研究發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)對雙歧桿菌的生長促進(jìn)活性與它們的二硫鍵有密切關(guān)系。

1.3.3 天然植物及中草藥浸提物

天然植物材料中，如番茄汁、胡蘿卜汁、平菇汁、黃芪等均含有雙歧桿菌需要的生長因子，一些中藥浸提物如枸杞中也含有較為豐富的雙歧因子。韓雪等[12]通過正交試驗研究了4種天然提取物平菇汁、卷心菜汁、豆?jié){、胡蘿卜汁對雙歧桿菌增殖的效果，按最佳配比添加后雙歧桿菌活菌數(shù)達(dá)2.58×109cfu/mL，較添加前增加2.95倍，。劉彥亮[13]研究了以黃芪浸提液為主要原料的黃芪復(fù)合增菌培養(yǎng)基，在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)雙歧桿菌16h后，活菌數(shù)可達(dá) 4.59×109cfu/mL。Szilard Kun 等[14]研究表明胡蘿卜汁對雙歧桿菌的增菌效果顯著，雙歧桿菌在單一的胡蘿卜汁中培養(yǎng)時菌落數(shù)可達(dá)108cfu/mL。

1.3.4 短鏈脂肪酸類和其它類

短鏈脂肪酸、乳酸菌素、稀土元素及無機(jī)鹽離子等也是對雙歧桿菌有增殖作用的雙歧因子。張樹和等[15]研究發(fā)現(xiàn)大豆多糖對雙歧桿菌增菌效果明顯與低聚果糖一致，具有益生元特性。郭思建等[16]發(fā)現(xiàn)乳酸菌素對雙歧桿菌有很強(qiáng)的促生長作用，且雙歧桿菌增菌效果與乳酸菌素濃度高低有密切關(guān)系，高濃度乳酸菌素液促進(jìn)雙歧桿菌生長效果較好。

2 發(fā)酵條件對雙歧桿菌生長的影響

2.1 pH值

pH值影響反應(yīng)液中物質(zhì)的電荷狀態(tài)，雙歧桿菌細(xì)胞內(nèi)酶氨基酸電離狀態(tài)和細(xì)胞內(nèi)酶的活性。舒國偉等[17]研究了pH值及接種量對兩株兩歧雙歧桿菌BB01、BB03生長的影響。結(jié)果表明，BB01、BB03的最適生長pH分別為6.5和6.0。提高菌株的耐酸性具有工業(yè)應(yīng)用價值，熊三玉等[18]通過反復(fù)馴化將兩歧雙歧桿菌馴化成耐氧耐酸耐膽鹽的優(yōu)良菌株，經(jīng)過耐酸馴化的菌株在低pH值條件下的產(chǎn)酸性明顯優(yōu)于未經(jīng)馴化的菌株。林娟等[19]采用馴化和紫外線誘變兩種方法選育雙歧桿菌耐酸耐氧菌株，與原始菌株相比，誘變株在pH4.5液體培養(yǎng)基中生長速度加快，衰亡速度減緩，在36h達(dá)最大活菌量，72h仍保持較高活菌量。

2.2 溫度和接種量

溫度和接種量在雙歧桿菌發(fā)酵過程中是兩個重要的因素。溫度對菌體的生長和發(fā)酵的影響是各種因素綜合表現(xiàn)的結(jié)果。適宜的溫度對菌體的增殖和產(chǎn)物的產(chǎn)量的提高有較大的影響。鮑行豪等[20]研究了培養(yǎng)液預(yù)溫對雙歧桿菌生長的影響，結(jié)果表明預(yù)溫后37℃培養(yǎng)20h即可達(dá)到菌體最高生物量，較預(yù)溫前提前12h。接種量對雙歧桿菌的生長也有一定影響，接種量增加，在相同時間內(nèi)對活菌總數(shù)有一定影響，研究表明雙歧桿菌培養(yǎng)最佳接種量為4%～5%。

2.3 氧

雙歧桿菌對氧及其敏感，有氧條件下雙歧桿菌會形成H2O2、O2-、HO·等活性氧，這些活性氧基團(tuán)在細(xì)胞內(nèi)積累會對細(xì)胞形成毒害作用。目前較多文獻(xiàn)研究了氧對雙歧桿菌生長的影響。據(jù)報道，氧氣會影響雙歧桿菌的糖代謝[21]。而雙歧桿菌葡萄糖代謝酶的基因在環(huán)境脅迫下也發(fā)生表達(dá)量的變化[22，23]。趙建云等[24]采用半定量RT-PCR法對在4%氧氣條件下培養(yǎng)的長雙歧桿菌BBMN68的葡萄糖代謝中關(guān)鍵酶基因m RNA表達(dá)水平進(jìn)行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，隨著氧氣濃度增加，長雙歧桿菌BBMN68的生長逐漸受到抑制，在氧質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%脅迫條件下，葡萄糖磷酸變位酶等多種酶在氧脅迫30min時的m RNA表達(dá)明顯下降?；陔p歧桿菌對氧要求嚴(yán)格的這一特性，使得其工業(yè)生產(chǎn)存在較多困難，如對生產(chǎn)設(shè)備要求較高、工藝過程較為繁瑣等。

因此對菌株進(jìn)行耐氧馴化或用基因技術(shù)獲得耐氧菌株是解決這一問題的有效方法。如張莉滟[25]利用電場誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法，融合了兼性厭氧菌保加利亞乳桿菌與長雙歧桿菌，篩選得到的融合子具有一定的耐氧性。李青青[26]利用考察篩選了9株雙歧桿菌的耐氧性，通過增加氧氣濃度的方式進(jìn)行復(fù)篩，得到的耐氧雙歧桿菌能抵抗液體培養(yǎng)時氧氣的攝入并能獲得較高的生長量。鑒定得出該耐氧雙歧桿菌為Bifidobacterium.animalis.subsp.lactis.

3 培養(yǎng)技術(shù)對雙歧桿菌發(fā)酵的影響

常用的生產(chǎn)雙歧桿菌的方法是分批培養(yǎng)，這種培養(yǎng)方法可造成底物耗盡和阻遏物的積累，使生物量和產(chǎn)物在培養(yǎng)后期不再增加呈穩(wěn)定狀態(tài)。為了解決分批培養(yǎng)出現(xiàn)的問題，現(xiàn)在研究的趨勢是高密度培養(yǎng)方法（High cell-density culture）。常用的高密度培養(yǎng)方法有分批補(bǔ)料培養(yǎng)、過濾培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)等，下面就分批補(bǔ)料培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)做詳細(xì)論述。

3.1 補(bǔ)料分批培養(yǎng)

補(bǔ)料分批技術(shù)解決了分批培養(yǎng)中底物的限制及產(chǎn)物的抑制。白文[27]研究了青春雙歧桿菌補(bǔ)料高密度培養(yǎng)的方法，以青春雙歧桿菌液體分批培養(yǎng)研究為基礎(chǔ)，補(bǔ)加堿液調(diào)整發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH，同時補(bǔ)加葡萄糖以消除碳源減少對雙歧桿菌增殖的抑制，使發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)對數(shù)期延長8h，最大活菌數(shù)由 3.9×108cfu/mL 提高到 4.6×109cfu/mL，實現(xiàn)了青春雙歧桿菌的高密度培養(yǎng)。倪雪朋等[28]研究了不同培養(yǎng)技術(shù)對耐氧兩歧雙歧桿菌生長的影響，結(jié)果表明流加培養(yǎng)效果最好，小瓶培養(yǎng)、發(fā)酵罐間歇培養(yǎng)次之。流加培養(yǎng)可延長雙歧桿菌生長周期，使雙歧桿菌的OD值達(dá)到1.167，活菌數(shù)達(dá)2.87×1010cfu/mL，明顯高于優(yōu)化培養(yǎng)基。

3.2 連續(xù)培養(yǎng)

曹郁生等[29]研究了雙歧桿菌厭氧連續(xù)培養(yǎng)的技術(shù)，連續(xù)培養(yǎng)方法較靜置批量培養(yǎng)得到的活菌數(shù)高活力好，單位容積的產(chǎn)量高。通過控制連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)pH值為6.0，采用不同稀釋率檢查其對培養(yǎng)物的影響，達(dá)到穩(wěn)定時分析其活菌數(shù)量、乳酸和乙酸產(chǎn)量。結(jié)果表明當(dāng)稀釋率為0.064h-1時，培養(yǎng)液中的活菌數(shù)達(dá)5.2×108cfu/mL。

4 發(fā)展與展望

21世紀(jì)功能性食品是食品發(fā)展的主流，滿足不同人群需要的特殊營養(yǎng)品已成為我國食品工業(yè)的發(fā)展重點(diǎn)，而雙歧桿菌的功能性恰好適合這一趨勢。目前對于雙歧桿菌在微生態(tài)制劑、功能性食品和藥品等方面的研究越來越多。因此優(yōu)化雙歧桿菌發(fā)酵工藝，實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)意義重大。

目前對于雙歧桿菌的研究在優(yōu)良菌株選育、耐氧馴化、冷凍干燥、微囊化等方面取得了一定的成果，解決了菌株高密度高活性培養(yǎng)的困難，以及對生產(chǎn)設(shè)備要求嚴(yán)格、不耐受胃酸等問題，為該菌的實際工業(yè)應(yīng)用提供了保障和可能。但鑒于雙歧桿菌本身固有的生理特點(diǎn)，目前我們還沒有完全掌握雙歧桿菌的特性，產(chǎn)品常溫下保存的穩(wěn)定性也有待提高。除此之外我們還需要通過控制發(fā)酵過程逐漸完善高密度發(fā)酵；通過完善發(fā)酵設(shè)備更好地監(jiān)測菌株生長狀態(tài)；結(jié)合發(fā)酵工藝，簡化操作工藝、降低成本實現(xiàn)雙歧桿菌生產(chǎn)的規(guī)模化產(chǎn)業(yè)化。

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